【摘要】：肥胖給全球人類(lèi)健康帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。如何有效的預(yù)防和控制肥胖的發(fā)生和發(fā)展已經(jīng)成為人類(lèi)急待解決的問(wèn)題。過(guò)去大量的研究表明蛋氨酸限制飲食(MRD)具有減少機(jī)體脂肪沉積、增加胰島素敏感性、改善氧化應(yīng)激和延長(zhǎng)壽命等許多有益于健康的生理作用。然而,MRD對(duì)機(jī)體系統(tǒng)代謝途徑的影響及其減少脂肪沉積的具體機(jī)理都還是未知的。本研究擬通過(guò)代謝組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、微生物組學(xué)、組織形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)等技術(shù)探究MRD對(duì)肥胖小鼠系統(tǒng)代謝的影響及其降脂的機(jī)理。其中研究方法、主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.基于代謝組學(xué)方法探究了MRD對(duì)高脂飲食(HFD)小鼠血液、尿液和結(jié)腸內(nèi)容物中代謝物的影響。結(jié)果表明,MRD降低了HFD小鼠的體重和體脂率,改善了血脂水平,降低了血漿中脂類(lèi)( CH_2 ,CH_2C=C,=CCH_2C=)和不飽和脂類(lèi)的水平,增加了血漿中β-羥基丁酸和乙酰乙酸以及尿液中β-羥基丁酸、乙酰乙酸和丙酮的水平,促進(jìn)了脂肪分解和脂肪酸氧化代謝;MRD降低了血漿中β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平,增加了血漿中檸檬酸以及尿液中乳酸、琥珀酸和α-酮戊二酸的水平,促進(jìn)了糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝;MRD增加了氨基酸分解代謝,但是降低了血漿中1-甲基組氨酸和3-甲基組氨酸的水平,減少了肌肉蛋白質(zhì)的分解代謝;MRD增加了腸道碳水化合物的分解發(fā)酵和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生、蛋氨酸等氨基酸的吸收、膽汁酸代謝和膽堿的利用率,降低了三甲胺和乙醇的吸收,改善腸道內(nèi)環(huán)境和組織損傷;MRD降低了血漿中炎癥蛋白O-乙酰糖蛋白和N-乙酰糖蛋白、尿液中尿囊素和硫酸吲哚酚的水平以及結(jié)腸內(nèi)容物中尿刊酸的水平,改善了炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。2.基于代謝組學(xué)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究了MRD對(duì)HFD小鼠肝臟代謝途徑的影響。結(jié)果表明,MRD降低了HFD小鼠肝臟重量和指數(shù)、肝臟脂肪空泡面積以及肝臟TG、TC和FFA的水平,抑制了肝臟的脂肪酸合成代謝,促進(jìn)了脂肪酸氧化、酮體的合成和降解、糖酵解、三羧酸循環(huán)和氨基酸分解代謝,增加了氧化磷酸化,減少了肝臟的脂肪沉積;MRD降低了肝臟蛋氨酸和半胱氨酸代謝,增加了�；撬岷吞鸩藟A利用,激活了自噬,上調(diào)了肝臟蛋白質(zhì)合成過(guò)程中DNA復(fù)制、RNA聚合酶、剪接體和核糖體等通路來(lái)維持肝臟的蛋白質(zhì)合成。MRD降低了肝臟嘌呤代謝以及尿囊素和TMAO的產(chǎn)生,增加了血漿和肝臟中T-AOC和H_2S的水平,降低了血漿和肝臟中自由基的水平,改善了肝臟氧化應(yīng)激;MRD增加了谷胱甘肽代謝、嘧啶代謝、膽汁分泌和初級(jí)膽汁酸合成,降低了泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、脂肪細(xì)胞因子和衰老相關(guān)疾病以及癌癥信號(hào)通路等;MRD改變了肝臟中許多miRNA的表達(dá),這些差異表達(dá)的miRNA調(diào)控的靶基因主要涉及調(diào)控脂肪酸合成、白色脂肪組織棕色化、自噬、糖酵解、三羧酸循環(huán)、硫化氫產(chǎn)生、炎癥、心肌損傷和衰老等相關(guān)的代謝通路。3.采用10周HFD誘導(dǎo)小鼠肥胖模型,探究MRD對(duì)肥胖小鼠肝臟脂代謝、自噬以及脂肪組織棕色化的影響。結(jié)果表明,MRD降低了肥胖小鼠的體重、血脂水平、肝臟重量、肝臟脂肪浸潤(rùn)面積以及肝臟TG和TC的水平,下調(diào)了肝臟脂肪合成代謝過(guò)程中關(guān)鍵基因(SREBP-1c、FAS、ACC-1和SCD1)和蛋白(FAS)的表達(dá),上調(diào)了肝臟脂肪分解代謝過(guò)程中關(guān)鍵基因(CrAT、FABP、PPARα、CPT-1、MCAD、FATP1、Acox-1、HSL、LPL、PKA、PerilipinA、ATGL、CYP7A1和CD36)和蛋白(HSL和p-HSL)的表達(dá),進(jìn)而降低了脂肪合成代謝,增加了脂肪分解代謝,減少了肝臟脂肪沉積;MRD降低了肥胖小鼠體脂和體脂率、iWAT和BAT的重量和脂肪細(xì)胞的體積,促進(jìn)了iWAT和BAT中棕色化的標(biāo)志性基因UCP1、PGC-1α、Prdm16和Cidea的表達(dá)以及UCP1蛋白的表達(dá),促進(jìn)了脂肪組織棕色化,降低了機(jī)體脂肪沉積;MRD上調(diào)了肝臟自噬標(biāo)志性基因(LC3A、LC3B、Atg4b、Atg7、ULK1、ULK2、Fip200、Beclin1、Lamp2α、Gabarap、Gabarapl1、Atg5、Atg8和Atg12)的表達(dá)、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B蛋白的表達(dá)、LC3BII/LC3BI的比值和Beclin1蛋白的表達(dá),下調(diào)了mTOR和p62蛋白的表達(dá),明顯增加了肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中自噬空泡的數(shù)量,促進(jìn)了肝臟自噬;MRD可能通過(guò)上調(diào)肥胖小鼠肝臟SIRT1-自噬和SIRT1-FGF21通路的表達(dá),促進(jìn)了肝臟脂代謝和脂肪組織棕色化,進(jìn)而減少了肝臟和機(jī)體的脂肪沉積;肥胖小鼠在MRD干預(yù)的條件下,肝臟蛋白質(zhì)的比例增加,肌肉總量保持不變。4.采用給飼喂MRD的肥胖小鼠腹腔注射自噬抑制劑氯喹(CQ)來(lái)驗(yàn)證MRD是否通過(guò)激活自噬減少了肥胖小鼠肝臟的脂肪沉積。結(jié)果表明,注射CQ增加了MRD小鼠肝臟LC3B基因和蛋白的表達(dá)以及LC3BII/LC3BI的比值,下調(diào)了mTOR蛋白的表達(dá),上調(diào)了Beclin1蛋白的表達(dá),但是卻導(dǎo)致了肝臟中p62蛋白以及自噬空泡的積累,抑制了MRD小鼠肝臟自噬;CQ增加了MRD小鼠血脂水平、增加了肝臟重量和指數(shù)、肝臟脂肪浸潤(rùn)面積以及肝臟TG和TC的水平,上調(diào)了肝臟脂肪合成代謝過(guò)程中關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá),下調(diào)了肝臟脂肪分解代謝過(guò)程中關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá),進(jìn)而增加了脂肪合成代謝,降低了脂肪分解代謝,導(dǎo)致了肝臟脂肪沉積增加;這些結(jié)果證明了MRD通過(guò)促進(jìn)自噬減少了肥胖小鼠肝臟脂肪沉積。CQ降低了MRD小鼠的體脂和體脂率、iWAT和BAT的重量和脂肪細(xì)胞體積,上調(diào)了MRD小鼠iWAT中UCP1、PGC1-α和Prdm16基因以及BAT中UCP1和PGC1-α基因的表達(dá),也上調(diào)了iWAT和BAT中UCP1蛋白的表達(dá),促進(jìn)了脂肪組織棕色化,減少了機(jī)體脂肪沉積;CQ抑制了自噬,可能導(dǎo)致了SIRT1-FGF21通路的過(guò)表達(dá),促進(jìn)了MRD小鼠脂肪組織棕色化,進(jìn)而降低了MRD小鼠體脂和體脂率,說(shuō)明了MRD促進(jìn)脂肪組織棕色化不是通過(guò)激活自噬實(shí)現(xiàn)的,而可能是通過(guò)促進(jìn)肝臟FGF21的表達(dá)和分泌實(shí)現(xiàn)的;CQ抑制了自噬,導(dǎo)致了肝臟蛋白質(zhì)含量的減少,也引起了機(jī)體肌肉總量的減少,說(shuō)明了在MRD條件下激活自噬是肝臟蛋白質(zhì)和機(jī)體肌肉總量保持不變的必要條件。5.研究MRD對(duì)肥胖小鼠腸道菌群的影響,并通過(guò)糞菌移植實(shí)驗(yàn)探究移植MRD小鼠的糞菌對(duì)肥胖小鼠腸道菌群、肝臟自噬和脂代謝以及脂肪組織棕色化的影響。結(jié)果表明,MRD增加了肥胖小鼠盲腸內(nèi)容物中有益菌Bifidobacterium、Lactobacillus、Faecalibaculum以及產(chǎn)丁酸菌Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia、Rikenellaceae_RC9_gut_group和Subdoligranulum的豐度以及降低有害菌Helicobacter和Erysipelatoclostridium的豐度,增加了盲腸中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。移植MRD小鼠的糞菌降低了肥胖小鼠的體重和血脂水平;移植MRD小鼠的糞菌增加了肥胖小鼠盲腸內(nèi)容物中Bifidobacterium以及丁酸產(chǎn)生菌Lachnospiraceae_NK4A136_group、Roseburia、[Ruminococcus]_torques_group和Intestinimonas的豐度,增加了短鏈脂肪酸,特別是丁酸的產(chǎn)生;移植MRD小鼠的糞菌增加了肝臟LC3BII/LC3BI比值和Beclin1蛋白的表達(dá),降低了mTOR和p62蛋白的表達(dá),明顯增加了肝臟細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中自噬空泡的數(shù)量,激活了肝臟自噬通路;移植MRD小鼠的糞菌降低了肥胖小鼠肝臟的重量、肝臟脂肪浸潤(rùn)面積比以及肝臟TG和TC的水平,下調(diào)了肝臟脂肪合成過(guò)程中關(guān)鍵蛋白FAS以及關(guān)鍵基因SREBP-1c、ACC-1和SCD1的表達(dá),上調(diào)了肝臟脂肪分解過(guò)程中關(guān)鍵蛋白HSL和p-HSL以及關(guān)鍵基因PPARα、LDL和CYP7A1的表達(dá),也降低了血漿中脂類(lèi)( CH_2 )的水平,增加了血漿中乙酰乙酸和β-羥基丁酸的水平,表明了移植MRD小鼠的糞菌抑制了肥胖小鼠肝臟脂肪合成代謝,促進(jìn)了肝臟脂肪分解代謝,減少了肝臟脂肪沉積;移植MRD小鼠的糞菌降低了iWAT和BAT的重量以及脂肪細(xì)胞的體積,上調(diào)了iWAT和BAT中UCP1基因和蛋白的表達(dá),促進(jìn)了脂肪組織棕色化;移植MRD小鼠的糞菌上調(diào)了肥胖小鼠肝臟SIRT1-自噬通路,促進(jìn)了肝臟自噬和脂代謝,減少了肝臟脂肪沉積;移植MRD小鼠的糞菌上調(diào)了肝臟SIRT1-FGF21通路,增加了FGF21的合成和分泌,促進(jìn)了脂肪組織棕色化,減少了機(jī)體脂肪沉積。其中丁酸及其產(chǎn)生菌Lachnospiraceae_NK4A136_group和Roseburia在這些過(guò)程中可能起著至關(guān)重要的作用。綜上所述,MRD通過(guò)重塑腸道菌群促進(jìn)了肥胖小鼠肝臟自噬和脂代謝以及脂肪組織棕色化,進(jìn)而減少了肥胖小鼠肝臟和機(jī)體的脂肪沉積。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TS201.4;TS201.2
【圖文】：

江南大學(xué)博士學(xué)位論文從第三周開(kāi)始體重極顯著高于 ND 組小鼠（P<0.01）。與 HFD 組小鼠相比，MRD 組小鼠體重從干預(yù)的第二周開(kāi)始顯著降低（P<0.05），第三周極顯著降低（P<0.01），且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)幾乎能一直保持與 ND 組小鼠相似的體重增長(zhǎng)趨勢(shì)。第 22 周結(jié)束時(shí)，與ND 組小鼠相比，HFD 組小鼠體重增加量極顯著增加（P<0.01），采食量顯著降低，能量攝入顯著增加，蛋氨酸攝入量顯著降低（P<0.05）；與 HFD 組小鼠相比，MRD 組小鼠體重增加量極顯著降低（P<0.01），采食量和能量攝入極顯著增加，蛋氨酸攝入量極顯著降低（P<0.01）。

圖 2-2 MRD 對(duì) HFD 小鼠體脂率和血脂水平的影響Figure 2-2 Effects of MRD on body fat rate and plasma lipid levels in HFD mice注：ND：正常飲食組；HFD：高脂飲食組；MRD：蛋氨酸限制+高脂飲食組。（A）代表性的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠 Micro-CT 掃描圖；（B）MRD 對(duì) HFD 小鼠體脂率的影響；（C）代表性的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠外觀(guān)照片圖；（D）MRD 對(duì) HFD 小鼠體長(zhǎng)的影響（體長(zhǎng)等于小鼠鼻尖到肛門(mén)的距離）；（E）MRD 對(duì)HFD 小鼠血漿 TG 水平的影響；（F）MRD 對(duì) HFD 小鼠血漿 TC 水平的影響；（G）MRD 對(duì) HFD 小鼠血漿 LDL-C 水平的影響；（H）MRD 對(duì) HFD 小鼠血漿 HDL-C 水平的影響；（I）MRD 對(duì) HFD 小鼠血漿 FFA 水平的影響。*表示與 ND 組相比有顯著性差異（P<0.05），**表示與 ND 組相比有極顯著性差異（P<0.01）；#表示與 HFD 組相比有顯著性差異（P<0.05），##表示與 HFD 組相比有極顯著性差異（P<0.01）。2.4.3 MRD 對(duì) HFD 小鼠 RER、能量支出和活動(dòng)量的影響如圖 2-3 所示，ND 組小鼠的 RER 值在 1.0 左右波動(dòng)，說(shuō)明其主要供能物質(zhì)是碳水化合物；HFD 和 MRD 組小鼠的 RER 值在 0.7-0.80 之間，說(shuō)明其主要供能物質(zhì)是脂肪。與 ND 組小鼠相比，HFD 組小鼠白天和黑夜的 RER 值極顯著降低，黑夜的能量支出極顯著降低（P<0.01）；與 HFD 組小鼠相比，MRD 組小鼠白天和黑夜的能量支出和自主活動(dòng)量顯著增加（P<0.05）。

本文編號(hào)：2728727