【摘要】：乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)是牛乳中一種微量的多功能糖蛋白,既可以調(diào)控骨骼生長(zhǎng)也可以調(diào)控免疫系統(tǒng),但目前在去卵巢小鼠體內(nèi)調(diào)控骨重建的相關(guān)機(jī)制并未闡述完全。因此,本研究從骨免疫學(xué)的角度,研究乳鐵蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松模型小鼠骨重建的影響以及乳鐵蛋白在小鼠體內(nèi)的消化和吸收情況,旨在闡明乳鐵蛋白通過(guò)骨免疫的方式調(diào)控骨重建的機(jī)制。首先,研究了乳鐵蛋白對(duì)小鼠骨骼系統(tǒng)的影響。建立了骨質(zhì)疏松小鼠模型,通過(guò)雙能X線吸收法、微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)和三點(diǎn)彎曲法等,得到結(jié)果如下:乳鐵蛋白可以明顯抑制去卵巢小鼠體重的增加,使去卵巢小鼠的全身骨密度提高了11.93%,使其血清中堿性磷酸酶活性升高了80.76%和抗酒石酸酸性磷酸酶活性降低了60.38%。同時(shí),乳鐵蛋白提高股骨的鈣磷含量,改善股骨的骨生物力學(xué)以及通過(guò)提高股骨骨小梁的骨體積分?jǐn)?shù)、厚度、數(shù)量和減少結(jié)構(gòu)模型指數(shù),從而改善股骨的微觀結(jié)構(gòu)。乳鐵蛋白促進(jìn)骨生成且抑制骨吸收,調(diào)控去卵巢小鼠骨系統(tǒng)的平衡。其次,研究了乳鐵蛋白對(duì)小鼠骨免疫系統(tǒng)的影響。通過(guò)液相懸浮多因子芯片技術(shù)對(duì)血清中的免疫因子進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)血清中IL-1α、IL-2、IL-3、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IFN-γ的含量升高、而IL-1α和IL-9含量下降,其中IL-5、IL-10、IL-12(p70)和IFN-γ可影響RANKL和OPG的分泌。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)RANKL和OPG的表達(dá),發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白可以使小鼠血清和T淋巴細(xì)胞分泌的RANKL/OPG比值分別下降57.14%和21.57%。同時(shí),乳鐵蛋白可以顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖,并能通過(guò)影響胸脾指數(shù)進(jìn)而調(diào)節(jié)小鼠的免疫功能。由此可知,乳鐵蛋白通過(guò)調(diào)控骨免疫系統(tǒng)的平衡,進(jìn)而調(diào)控骨重建的過(guò)程。接著,研究了乳鐵蛋白在小鼠體內(nèi)的消化和吸收情況。分別采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法,對(duì)小鼠胃腸道中的乳鐵蛋白肽進(jìn)行定性分析,在小鼠胃腸道內(nèi)容物中共鑒定到578條不同的乳鐵蛋白肽。通過(guò)生物信息學(xué)分析,篩選出活性肽LRPVAAEIY(LF-LR)。采用體外Caco-2單層細(xì)胞吸收模型,通過(guò)質(zhì)譜對(duì)肽LF-LR進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白肽LF-LR通過(guò)內(nèi)吞的方式被小腸上皮細(xì)胞吸收且具有良好的吸收率。同時(shí),在小鼠血清中可以鑒定到乳鐵蛋白肽LF-LR的存在,表明乳鐵蛋白肽LF-LR可能是乳鐵蛋白的活性片段之一。最后,研究了乳鐵蛋白肽LF-LR對(duì)骨免疫系統(tǒng)的影響。基于上述胃腸道中乳鐵蛋白肽的研究結(jié)果,利用MTT實(shí)驗(yàn)和分子對(duì)接方法對(duì)其中的五條肽進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,500 ng/mL乳鐵蛋白肽LF-LR可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖且可以與整合素受體α5β1結(jié)合調(diào)控成骨細(xì)胞的分化。同時(shí)乳鐵蛋白肽LF-LR中Leu和Pro可與TRAF6上的Glu448、Met450、Phe471和Tyr473結(jié)合,可以阻斷TRAF6與RANK的結(jié)合,從而調(diào)控RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路。同時(shí),含有PEQ三種氨基酸的乳鐵蛋白肽KESPQTHY、ESPQTHYY、ISQPEWFK和KPVTEAQ,也可以通過(guò)氫鍵和靜電用作用與TRAF6結(jié)合,均具有潛在的通過(guò)骨免疫通路調(diào)控骨重建的活性,有待進(jìn)一步研究。本研究闡述了乳鐵蛋白經(jīng)由免疫學(xué)途徑調(diào)控骨重建的活性機(jī)制,有效地豐富了乳鐵蛋白的生物學(xué)內(nèi)涵,為乳鐵蛋白在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS201.4
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學(xué)工學(xué)博士學(xué)位論文骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞均可產(chǎn)生 RANKL，RANKL 與破骨細(xì)胞體表面上的 RANK 受體結(jié)合，結(jié)合后使得 RANK 三聚化，加速腫瘤壞死因子關(guān)因子 6（TRAF6）與其結(jié)合，從而激活核內(nèi)的一系列轉(zhuǎn)錄因子，包括核因子（NF-κB）、c-Fos 和活化的 T 細(xì)胞核因子 NFATc1 等，最終將破骨細(xì)胞前體誘為成熟的破骨細(xì)胞，發(fā)揮破骨功能。然而，OPG 作為一個(gè)誘導(dǎo)受體，與 RANK爭(zhēng)性地結(jié)合 RANKL，抑制了破骨細(xì)胞的生成。RANKL/RANK/OPG 信號(hào)通路控了骨吸收和骨形成之間的平衡[54]，如圖 1-1。激活的 T 細(xì)胞，B 細(xì)胞以及樹(shù)狀細(xì)胞均可表達(dá) RANKL，且 RANK 也可由樹(shù)突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、B 細(xì)胞 T 細(xì)胞系表達(dá)。因此，在骨微環(huán)境里，RANKL/RANK/OPG 骨組織細(xì)胞和免細(xì)胞相互作用的匯合通路。

其肽的生物活性研究進(jìn)展分子結(jié)構(gòu)toferrin，LF）首次報(bào)道于 1939 年，是一種蛋白是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的一員，分子量為 精液、尿液及其他分泌物中[71]。每毫升人毫升牛乳中含有 0.01 mg-0.35 mg 乳鐵蛋白鐵蛋白的 10 倍，但牛乳的來(lái)源更豐富，仍結(jié)構(gòu)是由約 700 個(gè)氨基酸組成的單一的多結(jié)構(gòu)主要是由 α-螺旋構(gòu)象和 β-折疊構(gòu)象組)中 α-螺旋構(gòu)象比例為 33.47%，而 β-折疊構(gòu)和 β-折疊構(gòu)象在乳鐵蛋白分子中是交替排1-2，其具有兩個(gè)對(duì)稱的 N-葉和 C-葉，呈現(xiàn)出

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2720574