【摘要】：皮膚模型建立的方法至今已有30余年的歷史，伴隨組織工程技術(shù)的發(fā)展，建立皮膚模型已從單層表皮模型到復(fù)層皮膚替代物日趨成熟。國內(nèi)對于皮膚模型的研究尚處于起步階段，使用中國人皮膚建立替代模型，是當(dāng)前的研究重點。皮膚模型按照復(fù)雜程度分為上表皮模型、真皮模型和表皮—真皮（復(fù)層皮膚）模型3種。這些體外替代模型對于體內(nèi)、體外的毒理學(xué)評價具有重要意義。本課題旨在使用原代皮膚角質(zhì)細胞和成纖維細胞構(gòu)建皮膚模型。首先，要選擇合適生物材料作支架，并配制合適化學(xué)成分的培養(yǎng)基；繼而，取人體正常無病變組織，進行原代角質(zhì)細胞和成纖維細胞的分離培養(yǎng)；最后，待兩種細胞達到最佳生長狀態(tài)時，接種嵌入式培養(yǎng)皿中進行氣液培養(yǎng)，以形成多層的、高度分化的器官性組織模型。進行模型驗證首先要進行HE切片、免疫組化試驗以觀察模型生長狀態(tài)；第二要使用已構(gòu)建好的皮膚模型進行皮膚毒性檢測，本研究受試物為歐洲替代實驗確認(rèn)中心規(guī)定的用于皮膚刺激性的物質(zhì)中選取11種化學(xué)品，使用MTT法以及ELISA法檢測皮膚模型IL-1α因子的釋放量，以確定該模型的穩(wěn)定性、敏感性和準(zhǔn)確性，逐步建立皮膚毒性動物替代試驗的方法和平臺；最后，進行皮膚模型毒性評價的應(yīng)用，選取藥物化妝品8種，以評價該體系為基礎(chǔ)，檢測其毒性。 獲得主要結(jié)果包括：（1）成功構(gòu)建了2株不同年齡的成纖維細胞系；（2）使用鼠尾膠原構(gòu)建了膠原支架；（3）構(gòu)建了皮膚表皮模型；（4）HE染色和免疫組化試驗觀察模型與正常皮膚表皮相似；（5）模型驗證過程中，與動物試驗進行對比，準(zhǔn)確率達70%；（6）在藥物化妝品上成功進行了檢測應(yīng)用。
【圖文】：

0.25%胰酶消化，計數(shù) 0.5-1×106。PBS 洗 2 和 FITC 標(biāo)記的 Annexin-V（20 μg/mL）10 μL，室 μg/mL）5 μL，避光反應(yīng) 5 min 后，加入 400 μL B 進行流式細胞術(shù)定量檢測（一般不超過 1 h）， 同 及 PI 的一管作為陰性對照。培養(yǎng)醫(yī)院泌尿外科手術(shù)后的成人包皮組織，用含雙抗（素）浸泡 30 min，，去除血污并盡量去除皮下結(jié)締℃消化過夜，次日分離表皮與真皮；棄去真皮， 1），置入 15 mL 離心管中，加入組織量 2-3 倍 0 min 后取出，向離心管中加入 5 mL 含 10% FB吹打，1000 rpm/min 離心 10 min 去除上清，再次加，棄去上清，Epilife 培養(yǎng)基重懸接種于鋪被有重組7℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h 后換

e 第三代 f 第五代圖 2 Fbs 形態(tài)學(xué)觀察（×10）a：Fbs 分離后 48 h；b：Fbs 在 96 h 候逐漸呈成纖維狀；c：Fbs 第 6 d 時；d：Fbs 第一次傳代后培養(yǎng) 24 h；e：第三代 Fbs 生長狀態(tài)良好；f：第五代 FbsFig.2 The morphological observation of human dermal fibroblasts by enzymatic digestion for passages（×10）a 48 hours; b 96hours; c 6 days; d after the first passage 24hours; e the third passage; f the fifth passage4.1.2 成纖維細胞 HE 染色觀察成纖維細胞的形態(tài)呈梭形，靠近未消化完全組織塊附近也可見大多角形和扁平星形等向外爬出。核仁明顯，核呈橢圓形，可見 1-2 個核仁，胞體較大，胞質(zhì)弱嗜堿性，染色質(zhì)疏松著色淺。當(dāng)細胞匯流時，呈魚卵樣或漩渦狀排列，細胞在 10 代內(nèi)形態(tài)保持不變，經(jīng) HE 染色可以更清楚地觀察到這些表現(xiàn)（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：TS974.1;Q813

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3 李東杰;賈曉明;;低溫保存皮膚的細胞骨架在細胞力傳導(dǎo)中的作用[J];軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報;2007年01期

4 陳燕;牛燕雄;邵s

本文編號：2708515