【摘要】：雞蛋高密度脂蛋白(EYHDL),又叫做卵黃脂磷蛋白,是蛋黃(EY)中第二大類脂蛋白,其具有高磷脂、降血壓的特點(diǎn),是潛在的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子。本課題以EYHDL為研究對(duì)象,首先從雞蛋EY分離制備高純度EYHDL,并對(duì)其結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)組成進(jìn)行表征;利用小鼠營(yíng)養(yǎng)干預(yù)實(shí)驗(yàn),研究EYHDL對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝影響;通過(guò)對(duì)小鼠血清及肝臟脂質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)分析,探究EYHDL對(duì)脂質(zhì)代謝的可能作用;結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)及代謝物進(jìn)行系統(tǒng)分析,找尋EYHDL調(diào)控脂質(zhì)代謝的相關(guān)通路;最后開(kāi)展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)其調(diào)控代謝通路進(jìn)一步驗(yàn)證。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)建立了一種雙水相提取EYHDL的方法,比較了NaCl和(NH_4)_2SO_4兩種鹽溶液對(duì)EYHDL粗品純度和提取率的影響,結(jié)果表明利用NaCl結(jié)合PEG的方法可制備純度較高的EYHDL,在pH 4.5,聚乙二醇(PEG6000)添加量為4%時(shí)其純度(83.0%)和提取率(73.7%)最高。此方法不僅簡(jiǎn)化了步驟,而且環(huán)保高效。利用DEAE-650M陰離子柱實(shí)現(xiàn)了EYHDL的高效純化,隨后對(duì)純化后EYHDL的粒徑和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)其粒徑在10-20 nm左右,且其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角為主,表明此方法得到了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的EYHDL。(2)利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)和氣相質(zhì)譜(GC-MS)分析了EYHDL的脂質(zhì)組分。結(jié)果表明,磷脂酰膽堿(PC)為EYHDL中含量最高的脂質(zhì)組分,與EY相比,其甘油三脂(TG)的含量約為EY的1/4,其含有較高水平的脂酰膽堿(PC),磷脂酰肌醇(PI)和甘油二酯(DG)(p0.05)。差異脂質(zhì)比較結(jié)果表明,在ES+模式下,一共檢測(cè)到22種TG差異脂質(zhì),其在EYHDL中的含量均顯著低于EY(p0.01)。在ES-模式中,一共檢測(cè)到30種差異脂質(zhì),包括10種P-膽堿類(9種PC,1種溶血磷脂酰膽堿(LPC)),15種P-乙醇胺類(3種磷脂酰乙醇胺(PE),2種溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)),4種PI和1種鞘磷脂(SM)。相比于EY,EYHDL大多數(shù)PC和PE差異脂質(zhì)顯著提高(p0.01)。此外,GC-MS結(jié)果顯示,EYHDL較EY含有更高水平的C18:1和C22:6,以及更低水平的C16:0(p0.05)。(3)建立為期100天的高脂誘導(dǎo)代謝綜合征(MetS)小鼠模型,研究EYHDL對(duì)血脂相關(guān)指標(biāo)以及與脂代謝有關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,相比高脂(HFD)對(duì)照組,EYHDL攝入顯著抑制了小鼠體重增加和腹部脂肪組織積累,同時(shí)降低了血清低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)和TG濃度,以及肝臟TG和總膽固醇(TC)(p0.05)。此外,EYHDL攝入也增加了小鼠TC排泄量,減輕了脂肪肝病癥,改善了葡萄糖和胰島素耐受性。并對(duì)HFD組小鼠肝甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋-1c(SREBP-1c),乙酰輔酶A羧化酶1(ACACA),脂肪酸合成酶(Fasn),甘油-3-磷酸�；D(zhuǎn)移酶(GPAT)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)等相關(guān)基因的上調(diào)產(chǎn)生抑制作用。(4)利用GC-MS分析血清、肝臟和糞便中脂肪酸(FA)種類及含量的變化。結(jié)果表明,與HFD組相比,EYHDL可顯著降低小鼠血清中總脂肪酸(∑FA)和飽和脂肪酸(SFA)如C18:0和C16:0水平,以及肝臟中SFA(C14:0和C12:0)、單不飽和脂肪酸MUFA,C16:1、C16:0和C18:1和多不飽和脂肪酸PUFA,C18:3和C18:2水平(p0.05),并促進(jìn)PUFA如C18:2和C20:3的外排。隨后利用UPLC-MS/MS對(duì)60天和100天小鼠血清和肝臟脂質(zhì)組進(jìn)一步分析。與HFD相比,EYHDL可顯著降低血清中PC、FA和TG,并顯著提高肝臟中PI和SM(p0.05)。隨后利用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)找尋差異脂質(zhì),在血清中一共檢測(cè)到10種脂質(zhì)標(biāo)志物,其中5種PI,PI(16:0/18:2),PI(16:0/20:4),PI(18:0/20:3),PI(18:0/20:4)和PI(18:1/20:4)顯著下調(diào)(p0.01)。肝臟中一共檢測(cè)到8種下調(diào)DG,DG(16:0/18:2),DG(18:1/18:2),DG(18:1/20:4),DG(18:2/18:2),DG(18:2/20:4),DG(18:2/22:6),DG(18:3/18:2),和DG(22:5/18:2),2種下調(diào)TG(TG(18:1/20:3/22:6),TG(18:1/22:5/22:6)和3種下調(diào)的FA(C20:4,C20:5和C22:6)(p0.01),通過(guò)代謝通路分析,得出差異脂質(zhì)涉及到的主要代謝通路為甘油磷脂代謝。(5)建立了體外油酸(OA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪肝模型,探究EYHDL對(duì)于脂肪肝形成的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明,EYHDL可顯著抑制肝細(xì)胞內(nèi)TG脂滴的積累,同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)LPE及磷脂酰絲氨酸(PS)含量(p0.05)。差異脂質(zhì)結(jié)果表明,相比于OA對(duì)照組,EYHDL可顯著降低TG,并顯著提高與脂肪肝形成負(fù)相關(guān)的LPC、酰基肉堿(CAR)及神經(jīng)酰胺類(Cer)等物質(zhì)(p0.05),代謝通路分析也證實(shí)甘油磷脂代謝是最為相關(guān)的代謝路徑。此外,利用ESI-QTRAP-MS/MS對(duì)下游代謝物分析,在正負(fù)離子模式下分別檢測(cè)到297和230種代謝物。與OA對(duì)照組相比,一共鑒定到9種差異代謝物,分別是7種卵磷脂類(LPE 16:0,LPA 16:0,LPC 16:0,LPC18:0,LPC 20:2,LPC 17:0和LPC 18:3),1種甘油磷酸酯(Glycerol 3-phosphate)和1種脂質(zhì)(PAF C-16),其中所有檢測(cè)到的差異代謝物均在OA+EYHDL組中顯著下調(diào)(p0.01)。對(duì)代謝通路進(jìn)行分析,其中甘油磷脂代謝和膽堿代謝是最相關(guān)代謝。因此,脂質(zhì)組和代謝組相關(guān)路徑分析均表明EYHDL作用機(jī)制與甘油磷脂代謝有關(guān),與小鼠實(shí)驗(yàn)得到的相關(guān)代謝通路相互印證。(6)對(duì)甘油磷脂代謝路徑進(jìn)一步驗(yàn)證,長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)作為甘油磷脂代謝的原料,其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收異�？稍斐筛视土字x紊亂。因此,建立Caco-2和HepG2共培養(yǎng)體系,以評(píng)估EYHDL對(duì)于6種長(zhǎng)鏈脂肪酸C14:0,C16:0,C16:1,C18:0,C18:1,C18:2轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)態(tài)吸收的影響。結(jié)果表明,EYHDL可抑制C16:1和C18:2從Caco-2單層膜AP端相BL端的轉(zhuǎn)運(yùn),并抑制C16:0、C18:0和C18:1在HepG2細(xì)胞中積累,進(jìn)一步降低TG油滴的積累。對(duì)LCFA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白進(jìn)行Western-blot和RT-qPCR分析,結(jié)果表明,EYHDL通過(guò)抑制Caco-2脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(FATP2)和脂肪酸結(jié)合蛋白pm(FABPpm)從而抑制C16:1和C18:2的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)還降低HepG2細(xì)胞SREBP-1c及其下游脂肪生成基因ACACA和SCD1的表達(dá),抑制LCFA在肝組織中合成TG。
【圖文】：

3 及卵黃的 SDS-PAGE 凝膠電泳圖。Std, 標(biāo)準(zhǔn)分子量；y, 蛋黃高密度脂蛋白（Huopalahti et al 2007）PAGE gel electrophoresis of EYHDLand egg yolk. Std, standght; y, egg yolk; HDL, high density lipoprotein from egg yolk個(gè)單體是 5 個(gè)主要的載脂蛋白組成，分子量范圍為 3的含量分別是：110kDa：21%、100kDa：16%、80k

首次揭示 apoA-I 是 EYHDL 中主要的蛋白質(zhì)。更重要的是，apoA-I 是良好脂蛋白顆粒中的重要組分：它在 EYHDL 中定位及其它的一些結(jié)果，都強(qiáng)烈的寓示著EYHDL，至少大部分，都來(lái)自于雞血清。免疫電鏡表明 EYHDL 顆粒與 VLDL 顆粒并不共區(qū)域化，這些研究都表明EYHDL顆粒是從母雞的血清中吸收到卵母細(xì)胞中，然后通過(guò)不同于其它脂蛋白的吸收方式沉積在 EY 中。而雌性激素對(duì)雞的 EYHDL的脂質(zhì)和脂蛋白組成有影響，母雞或者雌性化的公雞擁有載脂蛋白 A-I（IapoA-II），并富含 TG。EYHDL 從卵母細(xì)胞到 EY 的機(jī)制與 EYLDL 不同。Shen 等表明 EYHDL 來(lái)源于血清中的 HDL，，通過(guò)卵母細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)行吸收。為了進(jìn)一步支持這一觀點(diǎn)，Vieira 等分別從公、母雞血清以及 EY 血清中分析了三種不同包裹網(wǎng)格蛋白的 EYHDL（見(jiàn)圖 1-3）（Vieira et al 1995）。發(fā)現(xiàn)這三種制備物均為球形顆粒，平均粒徑近 10nm，與典型哺乳動(dòng)物的 EYHDL 顆粒類似。采用免疫電鏡分析金標(biāo)記的 apoA-I 來(lái)定位 EYHDL 顆粒。EYHDL 集中位于電子致密顆粒中，這個(gè)結(jié)構(gòu)被認(rèn)為含有大部分的 EYHDL（見(jiàn)圖 1-4）（Shen et al 1993）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS253.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2691400