【摘要】：環(huán)糊精具有包合許多疏水性化合物而改善它們使用性能的作用,在各個(gè)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。工業(yè)上,環(huán)糊精的制備一般通過環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)作用于淀粉制備而成,但隨著產(chǎn)物的積累,會出現(xiàn)明顯的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象,是造成環(huán)糊精產(chǎn)量較低的一個(gè)重要因素,因此,如何降低環(huán)糊精生產(chǎn)過程中的產(chǎn)物抑制成為一個(gè)亟待解決的問題。本研究選取2種具有不同產(chǎn)物抑制類型的CGT酶(α-CGT酶來源于Paenibacillus macerans JFB05-01,β-CGT酶來源于Bacillus circulans STB01)為研究對象,通過生物信息學(xué)手段從酶一級結(jié)構(gòu)入手,深入分析酶結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物抑制的關(guān)系。然后,通過單突變、雙突變及片段替換對麥芽糖基結(jié)合位點(diǎn)2(MBS2)區(qū)域進(jìn)行分子改造,以研究MBS2區(qū)域?qū)GT酶產(chǎn)物抑制的影響,并對相關(guān)機(jī)理進(jìn)行了分析,同時(shí)期望得到產(chǎn)物抑制降低、具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的理想突變體。主要研究結(jié)果如下:(1)對CGT酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析,從一級結(jié)構(gòu)入手,深入分析造成CGT酶產(chǎn)物抑制的原因,明確與CGT酶產(chǎn)物抑制相關(guān)的區(qū)域及氨基酸殘基。根據(jù)α-CGT酶和β-CGT酶的產(chǎn)物抑制差異以及MBS2區(qū)域的特殊性,選定MBS2區(qū)域?yàn)檠芯磕繕?biāo),并選取該區(qū)域的600位點(diǎn)和603位點(diǎn)及整體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,為后續(xù)突變體的構(gòu)建提供指導(dǎo)。(2)選取MBS2區(qū)域的600位點(diǎn),分別設(shè)計(jì)了4個(gè)α-CGT酶單突變體(Y600L、Y600E、Y600I和Y600R)和4個(gè)β-CGT酶單突變體(L600Y、L600E、L600I和L600R)進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-CGT酶600位點(diǎn)突變既不改變α-CGT酶的產(chǎn)物抑制類型,仍為競爭性抑制,也不改變其產(chǎn)物抑制強(qiáng)弱;而β-CGT酶600位點(diǎn)突變體的產(chǎn)物抑制類型雖未發(fā)生改變,仍為線性混合型抑制,但其產(chǎn)物抑制強(qiáng)弱受到明顯影響�？梢酝茢�,環(huán)糊精對α-CGT酶產(chǎn)生的競爭性抑制與其非活性區(qū)域MBS2的600位點(diǎn)沒有相關(guān)性,而環(huán)糊精對β-CGT酶產(chǎn)生的線性混合型抑制尤其是非競爭性抑制與600位點(diǎn)有一定的關(guān)聯(lián)性。機(jī)理分析顯示,β-CGT酶600位點(diǎn)突變后,600位點(diǎn)處的氨基酸與環(huán)糊精之間的疏水相互作用減弱,進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)物抑制的降低。(3)選取MBS2區(qū)域的603位點(diǎn),分別設(shè)計(jì)了6個(gè)α-CGT酶單突變體(N603E、N603D、N603K、N603H、N603R和N603I)和6個(gè)β-CGT酶單突變體(N603E、N603D、N603K、N603H、N603R和N603I)進(jìn)行比較研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),603位點(diǎn)單突變對α-CGT酶和β-CGT酶的影響同600位點(diǎn)類似,但其中,2種酶的N603E和N603D競爭性抑制均發(fā)生明顯變化�？梢酝茢�,MBS2區(qū)域的603位點(diǎn)也與β-CGT酶的非競爭性抑制密切相關(guān),而2種酶N603E和N603D的競爭性抑制強(qiáng)度變化可能與另一個(gè)競爭區(qū)域(MBS1)有關(guān)。機(jī)理分析顯示,野生型β-CGT酶603位點(diǎn)處的Asn通過水介導(dǎo)的氫鍵與環(huán)糊精相結(jié)合,當(dāng)突變成帶負(fù)電荷的Glu、Asp或者疏水性的Ile時(shí),氫鍵被破壞,產(chǎn)物抑制降低,而突變成Lys、His和Arg后,側(cè)鏈氨基的存在仍導(dǎo)致氫鍵的存在,甚至更強(qiáng),產(chǎn)物抑制更嚴(yán)重。(4)在前面基礎(chǔ)上,對β-CGT酶設(shè)計(jì)了2個(gè)雙突變體(N603D/L600R和N603D/L600E)和片段替換突變體(MBS2-Bc DF9R)進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),N603D/L600R和N603D/L600E以及MBS2-Bc DF9R均具有更好的產(chǎn)物抑制降低效果。當(dāng)以5%麥芽糊精(DE=4)為底物進(jìn)行環(huán)糊精生產(chǎn)時(shí),在相同酶蛋白添加量下,雙突變體N603D/L600R和N603D/L600E的主產(chǎn)物β-環(huán)糊精比野生型分別高出43.7%和27.9%,具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

圖 1-2 CGT 酶的晶體結(jié)構(gòu)Fig. 1-2 Crystal structure of CGTase利用水解、歧化、環(huán)化和偶合功能催化淀粉糊精類[25,26]，反應(yīng)示意圖如圖 1-3 所示。其于淀粉或相關(guān)基質(zhì)生成環(huán)糊精，，是環(huán)糊精工

2圖 1-3 CGT 酶催化反應(yīng)示意圖[27]葡萄糖殘基，灰色小球代表還原性末端的葡應(yīng)；(B) 歧化反應(yīng)；(C) 環(huán)化反應(yīng)；(D) 偶. 1-3 Schematic of CGTase-catalyzed reactionst glucose resides and gray balls represent reduc Disproportion reaction; (C) Cyclization reactio化機(jī)理見圖 1-4，其發(fā)生在同一分子上物結(jié)合，在氨基酸 Asp229 和 Glu257 作一端靠近，形成環(huán)狀構(gòu)造；最后，OH
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS201.2

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本文編號：2687552