發(fā)布時(shí)間：2020-05-28 01:47

【摘要】：魚體肌肉生理變化過程與多種內(nèi)源性蛋白酶密切相關(guān)。脯氨酰內(nèi)肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP),屬于絲氨酸羧肽酶S9家族,是一類能特異性水解低分子質(zhì)量多肽鏈(33個(gè)氨基酸)羧基端脯氨酸殘基(Pro)的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶。本論文以鰱魚為研究對象,對其內(nèi)源性蛋白酶PEP進(jìn)行分析。采用硫酸銨分級沉淀,Q-Sepharose、Sephacryl S-200、Phenyl-Sepharose和Hydroxyapatite連續(xù)柱層析的方法對目標(biāo)蛋白酶進(jìn)行分離純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示,該酶的分子量約為80 kDa。Native-PAGE結(jié)果表明,該酶有兩種不同亞型。Western blotting顯示,該酶與兔抗羅非魚PEP多克隆抗體呈陽性反應(yīng)。肽指紋質(zhì)譜鑒定得到13個(gè)有效肽段,與斑馬魚、金線渻的PEP序列匹配度分別達(dá)100%、98%,確定該蛋白為鰱魚PEP。圓二色光譜分析顯示,鰱魚PEP二級結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲(32.2%)占比最多,β-折疊(27.4%)和α-螺旋(22.4%)次之,β-轉(zhuǎn)角(18.2%)占比最少。酶學(xué)性質(zhì)分析表明:PEP的最適溫度為35°C,最適pH為6.0。PEP特異性水解熒光底物羧基端的Pro殘基。金屬離子Cu~(2+)、Zn~(2+)、Al~(3+)及其特異性抑制劑SUAM-14746均對PEP表現(xiàn)出抑制作用。其中,SUAM-14746對PEP的抑制屬于競爭性的可逆抑制,抑制活性(IC_(50))為0.67μmol/L。PEP的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),米氏常數(shù)K_m為3.54μmol/L,催化常數(shù)k_(cat)為16.9/s。PEP在魚的腦、心、肝、肌肉、腸、脾、鰓中均有分布,腦組織中PEP表達(dá)量最高,心組織中次之,其他組織中表達(dá)量相當(dāng)。在哺乳動(dòng)物中,PEP通過水解蛋白肽參與機(jī)體新陳代謝。研究發(fā)現(xiàn),多種神經(jīng)退行性疾病患者體內(nèi)PEP活性顯著增加,PEP成為多種疾病治療的新靶點(diǎn)。海洋紅藻紫菜富含蛋白質(zhì),其中的藻紅蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)具有多種功能。壇紫菜模擬胃腸液消化產(chǎn)物具有PEP抑制活性。本研究以壇紫菜為原料,通過硫酸銨鹽析和DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等方法分離純化得到一種高純度R-PE(A_(565)/A_(280)=5.4)。參考人體對食物的消化模式,對純化R-PE進(jìn)行酶解以制備PEP抑制肽。經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化,酶解條件為:(1)胃蛋白酶與R-PE比例為0.5%(w/w),酶解時(shí)間30 min,pH 1.2,溫度37°C;(2)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶質(zhì)量比為1∶1的混合酶與R-PE比例為0.25%(w/w),酶解時(shí)間30 min,pH 7.5,溫度37°C。R-PE水解液用Superdex~(TM) peptide 10/300 GL凝膠柱和ZORBAX Eclipse Plus C18反相柱連續(xù)分離,收獲單一活性組分。將該組分進(jìn)行肽指紋質(zhì)譜鑒定,得到六個(gè)肽段與藻紅蛋白β鏈序列的匹配度達(dá)100%。選取十一肽MICENPGLIAP并預(yù)測其經(jīng)胃蛋白酶和胰腺酶水解后的消化特性,得到兩個(gè)三肽:PGL和IAP。通過分子對接模擬分析顯示,PGL對PEP表現(xiàn)出非競爭性抑制,IAP對PEP表現(xiàn)出競爭性抑制。體外活性驗(yàn)證結(jié)果顯示,IAP對PEP(哺乳動(dòng)物)的抑制活性(IC_(50))為1.49 mmol/L。本論文較為詳細(xì)地研究了淡水鰱魚PEP的酶學(xué)性質(zhì),為探究PEP在魚機(jī)體中的生理功能提供理論基礎(chǔ)。利用食源性蛋白質(zhì)R-PE酶法制備PEP抑制肽的研究,為生物活性肽的制備提供技術(shù)支持和理論參考。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.1

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本文編號：2684504