【摘要】：D-甘露糖是D-葡萄糖C-2位的差向異構體,也是D-果糖的醛糖異構體。它具有益生元活性,可參與免疫調節(jié),也可作為工業(yè)化生產(chǎn)功能性甜味劑甘露醇的原料。L-核糖是D-核糖的對應異構體,是一種稀有糖。作為一種重要的醫(yī)藥中間體,L-核糖可合成具有抗人類免疫缺陷病毒、巨細胞病毒和肝炎病毒活性的L-核苷類衍生物。近年來,D-甘露糖和L-核糖的生物合成受到了國內外學者的極大關注。D-來蘇糖異構酶(D-Lyxose isomerase,EC 5.3.1.15)是一種醛糖-酮糖異構酶,可催化多種單糖之間的異構化反應,包括D-木酮糖和D-來蘇糖,D-果糖和D-甘露糖以及L-核酮糖和L-核糖等。本課題主要研究了來源于嗜熱細菌Peptococcus bacterium 1109的D-來蘇糖異構酶,并分別構建了D-葡萄糖異構酶和該酶的共表達體系,實現(xiàn)從D-葡萄糖一步法生產(chǎn)D-甘露糖,以及L-阿拉伯糖異構酶和該酶的共表達體系,實現(xiàn)從L-阿拉伯糖一步法生產(chǎn)L-核糖,探索經(jīng)濟制備D-甘露糖和L-核糖的有效途徑。來源于P.bacterium 1109的編碼D-來蘇糖異構酶基因片段的GenBank登錄號為KLU40859.1,全長543 bp�？寺≡撈�,并將其連接至pET-22b(+)載體上構建重組質粒,導入E.coli BL21(DE3)中,加入IPTG誘導酶過量表達,使用鎳離子親和層析分離純化目的蛋白,SDS-PAGE檢測結果顯示蛋白分子量約為21 kDa,與理論分子量結果相一致。凝膠排阻色譜結果顯示蛋白全分子量約為42 kDa,推測重組酶為同源二聚體。P.bacterium 1109 D-來蘇糖異構酶的最適pH為7.5,最適溫度為70℃,Co~(2+)可以顯著提高其活力。該酶在70℃和75℃下比較穩(wěn)定,最適底物為D-來蘇糖,對D-果糖,D-甘露糖,L-核糖均有催化活性。以D-果糖為底物時,重組D-來蘇糖異構酶的比酶活可達2.5±0.2 U/mg。以500 g/L的果糖為底物,在最適條件下反應8 h達到平衡,得到D-甘露糖96.0 g/L,平衡轉化率19.2%。將來源于Acidothermus cellulolyticus的D-葡萄糖異構酶和P.bacterium 1109 D-來蘇糖異構酶的編碼基因分別連接至質粒pCDFDuet-1上,構建重組共表達質粒并導入E.coli BL21(DE3),進行發(fā)酵培養(yǎng)。重組共表達細胞可利用D-葡萄糖生產(chǎn)D-果糖和D-甘露糖,體系的最適反應條件為pH 6.0和70℃,最適金屬離子為Co~(2+),在60℃及以下具有較好的熱穩(wěn)定性。以500 g/L的D-葡萄糖為底物,可得到185.0 g/L的D-果糖和62.6 g/L的D-甘露糖。構建Alicyclobacillus hesperidum L-阿拉伯糖異構酶和P.bacterium 1109 D-來蘇糖異構酶的共表達體系,研究重組共表達細胞利用L-阿拉伯糖產(chǎn)L-核酮糖和L-核糖的能力。該體系的最適反應條件為pH 6.5和65℃,最適金屬離子為Co~(2+),50℃時具有一定的熱穩(wěn)定性。以500 g/L的L-阿拉伯糖為底物,可得到85.6 g/L的L-核酮糖和45.9 g/L的L-核糖。
【圖文】：

圖 1-1 D-甘露糖結構式Fig. 1-1 Structure of D-mannose（A）α-D-甘露吡喃； （B）β-D-甘露吡喃界，甘露糖通常以甘露聚糖或半纖維素的組分形式存在[13]。茶籽清球蛋白、卵類粘蛋白和一些真菌中含有甘露聚糖，咖啡渣中的[9]。甘露糖在柑橘皮等植物果皮中為游離狀態(tài)。桃、蘋果類水果。甘露糖添加到食物體系中，可以和體系中的蛋白質發(fā)生美拉德]。盡管甘露糖在人體內的濃度小于葡萄糖濃度的五十分之一，但程中起著十分重要的作用[15]。糖的生理功能及應用作為功能性甜味劑，具有益生元功能[16]。D-甘露糖是人體內生物糖蛋白的一個重要的代謝中間產(chǎn)物，當其進入人體后，血糖濃度直接被轉化為糖原儲存能量利用[17-19]。單獨服用甘露糖可以抑制鼠的腫瘤生長，結合化療藥物服用甘露糖后，能夠增強針對多種-甘露糖可以通過對 T 細胞的免疫調節(jié)進而抑制 I 型糖尿病和肺

的方法將混合糖漿分離，，收集分離液可直接得到純度 90%以上的 D-甘露糖。1.2.3.3 生物法制備 D-甘露糖甘露糖的生物法制備主要以D-果糖為原料，利用單糖異構來實現(xiàn)（圖1-2），也有少數(shù)報道以D-葡萄糖為原料差向異構化生產(chǎn)甘露糖。D-甘露糖異構酶（EC 5.3.1.7）、纖維二糖差向異構酶（EC 5.1.3.11)和D-來蘇糖異構酶（EC 5.3.1.15）都具備D-甘露糖生產(chǎn)能力。但是，目前鑒定的D-甘露糖異構酶大多催化效率不高，且最適反應溫度較低，在30°C至60°C之間。Hu等[45]克隆了來源于E.coli BL21的mRNA酶編碼基因（yihS）在枯草芽孢桿菌WB800中表達，在45°C，pH 7.0的條件下，以D-果糖為底物，可實現(xiàn)約為25%的D-甘露糖轉化率。Takasaki等[46]利用來源于Pseudomonas sp.的D-甘露糖異構酶
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS218

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本文編號：2684496