【摘要】：鐵元素是人體最重要的礦物質(zhì)元素之一,在人體的循環(huán)代謝過程中起著重要作用。世界衛(wèi)生組織的報告顯示,全世界有10-30%的人群具有不同程度貧血癥狀,而這其中大多數(shù)的貧血癥狀是由缺鐵引起的。目前常用亞鐵鹽如硫酸亞鐵、鐵富馬酸鹽和葡萄糖酸亞鐵等作為口服補鐵劑,然而長期服用上述口服補鐵劑時,會引起胃腸道副作用和鐵誘導(dǎo)的過氧化應(yīng)激反應(yīng)。一些臨床研究已經(jīng)顯示長期服用治療性硫酸亞鐵口服劑會引起惡心、嘔吐、腹痛和便秘等胃腸道副作用。多糖鐵復(fù)合物具有穩(wěn)定性高、水溶性好和副作用少等特點,是一種理想的補鐵劑,具有成為抗缺鐵性貧血活性藥品及保健產(chǎn)品輔料的潛力。黑木耳是一種我國特有的生長在朽木上的黑色腐生菌,作為藥食同源的食用菌在1000年前就已開始被廣泛食用。我國黑木耳年產(chǎn)量約為650萬噸,其中部分因菌種管理混亂、質(zhì)量不穩(wěn)定、精深加工不足等問題而造成浪費,增加了產(chǎn)業(yè)環(huán)保壓力,影響產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。黑木耳多糖是黑木耳中重要的功能成分,其具有抗氧化、抗凝血、提高免疫力及抗腫瘤等生物活性,可作為絡(luò)合鐵元素的潛在配體。本研究以黑木耳為原料,采用超聲波微波輔助協(xié)同提取及分離純化得到黑木耳多糖,采用改良的三氯化鐵法以黑木耳多糖與鐵元素復(fù)合制備黑木耳多糖鐵復(fù)合物。然后對黑木耳多糖鐵復(fù)合物的一般理化特性、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性進行研究,最后構(gòu)建缺鐵性貧血癥大鼠模型,對黑木耳多糖鐵復(fù)合物進行抗缺鐵性貧血活性及急性毒性評價。本研究成果如能在實際工業(yè)生產(chǎn)中得以應(yīng)用發(fā)展,不僅可大幅提高黑木耳的附加值,延長黑木耳精深加工產(chǎn)業(yè)鏈,產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟、社會及環(huán)境效益,還有助于補充市場上補鐵補血產(chǎn)品的市場缺口,具有良好的應(yīng)用價值與廣闊的市場前景。研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)以黑木耳為原料,超臨界萃取脫脂后,采用超聲波微波輔助協(xié)同提取黑木耳多糖,通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗考察料液比、超聲波功率、微波溫度及協(xié)同作用時間對黑木耳多糖得率的影響。結(jié)果表明,四個因素對黑木耳多糖得率的影響程度依次為超聲波功率料液比微波溫度協(xié)同作用時間。超聲波微波輔助協(xié)同提取黑木耳多糖的最佳提取工藝條件為:料液比(g/mL)1:80、超聲波功率240W、微波溫度85℃、協(xié)同作用時間20min,在此條件下黑木耳多糖的得率為9.42±0.12%,采用大孔樹脂法對黑木耳多糖進行脫蛋白、脫色素處理,蛋白和色素去除率分別達到80.2±1.12%和87.4±1.25%,多糖損失率為16.6±0.45%。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析及Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析后,得到黑木耳純化多糖,命名為AAPS。以凝膠滲透色譜法(GPC)測定黑木耳多糖(AAPS)分子量,得到其重均分子質(zhì)量(Mw)為1.42×10~6u,數(shù)均分子量(Mn)為3.57×10~5u。以PMP柱前衍生高效液相色譜法分析黑木耳多糖(AAPS)的單糖組成,結(jié)果表明黑木耳多糖(AAPS)主要是由甘露糖(Man),葡萄糖醛酸(GlcA),葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)四種單糖以不同摩爾比組成,摩爾比為3.62:7.23:12.57:4.24。(2)以黑木耳純化多糖為原料,制備黑木耳多糖鐵復(fù)合物,通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)體系pH及檸檬酸三鈉添加量四個因素對黑木耳多糖鐵復(fù)合物含鐵率的影響。結(jié)果表明,四個因素對黑木耳多糖鐵復(fù)合物含鐵率的影響程度依次為反應(yīng)體系pH檸檬酸三鈉添加量反應(yīng)時間反應(yīng)溫度。黑木耳多糖鐵復(fù)合物制備的最佳工藝條件為:反應(yīng)溫度75℃、反應(yīng)時間75min、反應(yīng)體系pH9及檸檬酸三鈉添加量30mg,在此條件下黑木耳多糖鐵復(fù)合物含鐵率為28.42±0.16%。制備的黑木耳多糖鐵復(fù)合物(AAPS-iron(Ⅲ))為紅棕色無定形粉末,無嗅無味,易溶于水,不溶于乙醇、甲醇等有機溶液。在pH值2.5-12范圍內(nèi)具有穩(wěn)定性。易吸潮,須在密封干燥條件下保存。鐵離子鑒別試驗結(jié)果表明黑木耳多糖鐵復(fù)合物(AAPS-iron(Ⅲ))中不含游離的鐵離子,黑木耳多糖與鐵互相結(jié)合而非物理性混合。(3)采用掃描電子顯微鏡(SEM)、激光粒度分布儀對黑木耳多糖及黑木耳多糖鐵復(fù)合物的微觀形態(tài)進行分析與表征,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖與鐵元素復(fù)合后,其微觀粒子表面由絮狀形態(tài)變?yōu)槠瑺罱Y(jié)構(gòu),并且由粗糙變?yōu)槠秸?粒徑明顯增大。采用熱重分析法(TG)對黑木耳多糖及黑木耳多糖鐵復(fù)合物的熱穩(wěn)定性進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖與鐵元素復(fù)合后,其熱穩(wěn)定性增強,受熱后熱分解過程由劇烈轉(zhuǎn)為緩和。黑木耳多糖鐵復(fù)合物在50℃-256℃的溫度范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。采用紅外光譜法(FT-IR)、圓二色譜法(CD)、核磁共振氫譜法(NMR ~1H)對黑木耳多糖及黑木耳多糖鐵復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖與鐵元素復(fù)合形成了β-FeOOH晶體結(jié)構(gòu)。黑木耳多糖鐵復(fù)合物核磁共振圖譜上除重水峰外,不存在其它明顯的共振吸收峰。進一步說明了黑木耳多糖與鐵元素互相結(jié)合而非物理性混合。黑木耳多糖鐵復(fù)合物的體外鐵元素溶出度試驗結(jié)果表明,黑木耳多糖鐵復(fù)合物在模擬的胃腸環(huán)境中,鐵元素溶出度可達到93.1%,說明其在胃腸道環(huán)境中表現(xiàn)出較好的水溶性,有利于鐵的吸收,具有良好的生物利用能力。黑木耳多糖鐵復(fù)合物抗氧化活性試驗結(jié)果表明,在濃度1.0mg/mL時,黑木耳多糖鐵復(fù)合物的DPPH自由基清除活性與ABTS自由基清除活性分別達到39.5%、35.9%,其對肝脂質(zhì)過氧化抑制率達到43.1%。證明黑木耳多糖鐵復(fù)合物具有良好的抗氧化活性。(4)黑木耳多糖鐵復(fù)合物高劑量組能使缺鐵性貧血大鼠血液中HB、RBC、HCT、MCV、MCH、MCHC的含量逐漸恢復(fù),說明黑木耳多糖鐵復(fù)合物高劑量組對貧血大鼠具有明顯的輔助治療作用。黑木耳多糖鐵復(fù)合物高劑量組能使血紅細胞內(nèi)游離原卟啉含量較模型組明顯降低,說明黑木耳多糖鐵復(fù)合物能改善貧血大鼠體內(nèi)缺鐵狀況。黑木耳多糖鐵復(fù)合物高劑量組能明顯使血清鐵、血鐵飽和度含量升高,總鐵結(jié)合力明顯降低。黑木耳多糖鐵復(fù)合物高劑量組能使動物體重增長明顯,一般情況得到改善,動物的外觀活動和行為、毛色都逐漸恢復(fù)至正常。通過對大鼠肝臟中SOD和MDA含量測定結(jié)果分析,高劑量組能顯著提升大鼠肝臟內(nèi)SOD水平,降低大鼠肝臟內(nèi)MDA含量,表明黑木耳多糖鐵復(fù)合物具有提高肝組織抗氧化能力及抑制肝組織脂質(zhì)過氧化的作用。小鼠急性毒性試驗結(jié)果表明,黑木耳多糖鐵復(fù)合物最大灌胃給藥量為13g/(kg·d),此劑量相當(dāng)于臨床劑量的205倍,給小鼠灌胃后,小鼠體重增值屬于正常增長范圍,未出現(xiàn)有中毒或者死亡現(xiàn)象,剖檢后也沒發(fā)現(xiàn)組織臟器有明顯變化。黑木耳多糖鐵復(fù)合物的LD_(50)15000mg/kg。綜上說明黑木耳多糖鐵復(fù)合物安全可靠,屬于無毒級。
【圖文】：

2.2.3.2 超聲波微波輔助協(xié)同提取黑木耳粗多糖的試驗設(shè)計準(zhǔn)確稱取5.00g脫脂黑木耳，使用粉碎機粉碎后過篩得到一定粒度的脫脂黑木耳粉。以一定料液比加入蒸餾水，置于球形冷凝器中，放入反應(yīng)儀連接（如圖2.1所示）。打開的磁力攪拌裝置，并設(shè)定磁力攪拌速率，啟動超聲波發(fā)生器和微波發(fā)生器進行協(xié)同提取，反應(yīng)一定時間后，將提取液以4000r/min使用冷凍離心機在15℃條件下離心20min，棄沉淀，取上清液進行濃縮，將得到的多糖溶液加入4倍體積的80%乙醇溶液，于4℃環(huán)境下靜置醇沉4小時。然后以4000r/min使用冷凍離心機在15℃條件下離心20 min，棄上清液，取沉淀，分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌沉淀3次，在通風(fēng)櫥內(nèi)將沉淀低溫水浴，使殘留有機溶劑蒸發(fā)

入1.0mL的苯酚溶液（5%）及5.0mL的濃硫酸，小心的震蕩混勻，25℃水浴半小時，使用紫外分光光度計于490nm波長處檢測樣品吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖2.2所示。得到的線性方程為：y=0.0018x+0.0025，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，，說明線性方程可信。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS219;TS201.4

【參考文獻】

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本文編號：2659551