【摘要】：隨著社會經(jīng)濟水平的不斷發(fā)展和人民生活品質(zhì)的提升,魚類及其制品因其具有豐富的營養(yǎng)和鮮美的味道,日益受到消費者的喜愛。但是魚類也是八類食物過敏原中的一類,而在因食用魚類導(dǎo)致的食物過敏反應(yīng)主要是由小清蛋白構(gòu)成的。目前已有的一些檢測方法,例如PCR、質(zhì)譜、ELISA等,均存在著諸如費用昂貴、耗時、缺乏廣譜性等缺點。因此,一種能夠快速、準確、全面檢測小清蛋白的方法有著重要的意義。多分子振動光譜可以對復(fù)雜體系的混合樣本進行快速、無損以及多成份同時檢測,不僅能夠獲取樣本的整體信息輪廓,也可以得到樣本的空間構(gòu)型信息,目前該方法以及在食品、材料、中藥等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,本研究使用的中紅外光譜也是一種多分子振動光譜。通過三氯乙酸(TCA)沉淀的方法提取純化小清蛋白,然后分別收集16種魚類的小清蛋白,其粗蛋白,以及不含小清蛋白的粗蛋白分成A、B、C三組,并采集其紅外光譜,將原始譜圖與其二階導(dǎo)數(shù)譜圖經(jīng)矢量化處理后,通過多種算法支持向量機(SVM),隨機森林(RF),神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(IRN)建立小清蛋白的識別模型,完成了小清蛋白的定性檢測,利用定性檢測所得的特征信息構(gòu)建定量模型,最后將以上所有數(shù)據(jù)整合到數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建成小清蛋白紅外數(shù)據(jù)庫,其詳細信息如下:1.小清蛋白具有Ca~(2+)結(jié)合位點屬于EF家族,該結(jié)構(gòu)對酸具有耐受性,因經(jīng)過多次TCA沉淀,所得的小清蛋白的電泳條帶呈現(xiàn)出明顯的一條帶,且所得小清蛋白與報道過的EG8抗體發(fā)生了特異性免疫反應(yīng)。2.利用魚類的小清蛋白,其粗蛋白,以及不含小清蛋白的粗蛋白的紅外光譜這三個樣本組,每個中有136個樣本,每個樣本有12條重復(fù),該數(shù)據(jù)集按3:7分為訓(xùn)練集和測試集。對SVM、RF、IRN三種模型進行訓(xùn)練,模型參數(shù)經(jīng)優(yōu)化后分別為:SVM采用高斯核函數(shù),懲罰因子為5,步長為1;RF模型的決策樹數(shù)目為60,每棵樹的最大深度為8;IRN模型有9層構(gòu)成,隱藏層采用Inception-Resnet-V2的結(jié)構(gòu),dropout取0.75,softmax采用logits。三種模型在測試集樣本上的準確率分別為,在組的水平上(A、B、C)三個模型的準確率為IRN(92.5%,85%,95%),SVM(75%,85%,75%),RF(60%,75%,85%),在總體水平上三個模型的準確率為IRN(97.3%),SVM(83.3%),RF(93.3%)。綜合來看,IRN模型是最優(yōu)的。3.小清蛋白的共有序列有blast-p可知主要由Asp,Ser,Glu和Asn構(gòu)成,對比這四種氨基酸殘基的紅外特征吸收有三種模型的得出的小清蛋白特征光譜區(qū),可以看出IRN模型對于小清蛋白特征提取比例是要高于其他兩種模型的,這樣它們的內(nèi)部驗證結(jié)果相一致。同時,所得特征區(qū)域為1644,1543,1265,1240,1155,1051,1010±5cm~(-1),在不同組樣本的二階導(dǎo)數(shù)光譜的這些區(qū)域均發(fā)現(xiàn)其峰強存在差異。在魚糜中加入不同含量的小清蛋白制成用于模型外部驗證的樣本集,對三個模型的驗證結(jié)果為,IRN(91%)RF(70%)SVM(35%),IRN模型對于小清蛋白的檢測限為0.1~0.3mg/kg。4.利用紅外光譜定量的方法建立了魚糜中小清蛋白含量的定量預(yù)測模型。其中用于模型構(gòu)建的校正組的小清蛋白含量分別為每100g魚糜中有0,5,10,20,30,40,50和60mg,以定性模型所得特征峰和小清蛋白含量之間的線性關(guān)系為依據(jù)構(gòu)建模型,所得模型的R~20.99,標準偏差為2.75。然后,利用小清蛋白含量為5,15,25和35mg的樣本對模型進行外部驗證,并對預(yù)測值和真實值進行了t檢驗,結(jié)果表明,當小清蛋白含量0.25mg,顯著性P值大于0.05,表明此時模型是可以準確預(yù)測小清蛋白的含量。5.整合16種魚類的基本信息,以及其相應(yīng)過敏原小清蛋白紅外光譜的原始與二階導(dǎo)數(shù)譜圖,將所有數(shù)據(jù)存放于MySQL數(shù)據(jù)庫,利用Django構(gòu)建數(shù)據(jù)庫的可視框架以相關(guān)查詢接口,將所有文件存儲到云服務(wù)器,為服務(wù)器綁定域名www.guominyuan.online。最終,得到一個開放的小清蛋白過敏原數(shù)據(jù)庫。
【圖文】：

Resnet和Inception的結(jié)構(gòu)

圖 2-3 小清蛋白 SDS-PAGE 電泳結(jié)果 M：Marker(6-66kDa)Fig. 2-3 SDS-Page of Pa5.2 BCA 蛋白定量結(jié)果圖 2-4 為 BCA 標準蛋白曲線，其 R2=0.9942，，線性相關(guān)良好。測定未知濃度蛋白的 450nm 的 OD 值，帶入計算式(1)，即可算出樣本中小清蛋白的濃度。計算出的小清蛋白的濃度，進行后續(xù) ELISA 反應(yīng)體系的構(gòu)建。y = 0.0011x + 0.0698 y = 0.0011x + 0.0698R2= 0.99890.40.50.60.7
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS254.1;O657.33

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本文編號：2638745