發(fā)布時(shí)間：2020-04-10 01:50

【摘要】：羊乳及牛乳是兩種重要的乳源,與牛乳相比,羊乳脂肪球較小,干物質(zhì)含量較高,致敏性低,酪蛋白和清蛋白比例更接近人體,更利于人體消化吸收。由于羊的泌乳量小,養(yǎng)殖規(guī)模不大,易受到資源及季節(jié)性等因素的影響,使得羊乳的生產(chǎn)成本較牛乳高,致使部分商家向羊乳中摻入牛乳,損害消費(fèi)者利益,干擾正常的羊乳產(chǎn)品市場,亟待建立快速可靠的區(qū)別檢測技術(shù)。本課題通過兩種電泳法研究分析牛羊乳蛋白質(zhì)的差異性,以β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)為檢測對象,制備多克隆和單克隆抗體,基于抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性,建立酶法及膠體金標(biāo)記層析法進(jìn)行牛羊乳的區(qū)別檢測。其主要的研究結(jié)果如下:(1)牛羊乳β-LG的分離制備。采用HCl法沉淀酪蛋白得出1.0mol/L HCl獲得的清蛋白含量高,電泳顯示酪蛋白沉淀完全。確定了酸法分離乳清中β-LG最佳pH條件,牛乳pH3.9,羊乳pH 3.3。檸檬酸法比鹽酸分離牛羊乳β-LG的蛋白得率增加了20%以上。在SDS-PAGE條件下,牛羊乳β-LG條帶只有一個(gè)。但在非變性電泳條件下,牛乳β-LG條帶2個(gè),處于條帶最下方;而羊乳中只有一條β-LG條帶,位于中間位置。因此以β-LG作為特征目標(biāo)蛋白,來鑒別牛羊乳。(2)牛β-LG多克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用。牛β-LG免疫兔子,四免后測得血清效價(jià)達(dá)到1:20000,獲得抗血清。Protein A親和色譜純化后,抗體純度達(dá)到90%以上,抗體效價(jià)為1:102400,抗體無明顯交叉反應(yīng),特異性好,可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。建立間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分析羊乳中摻入牛乳。確定了β-LG最佳包被濃度為1:320mg/mL,羊乳中摻入脫脂牛乳最低檢出量為3.5%,板內(nèi)變異系數(shù)(CV)小于5%,可有效地區(qū)別牛羊乳。建立了3種基于多克隆抗體的膠體金免疫層析試紙條法。標(biāo)記膠體金的最適pH值為8.0,最佳蛋白標(biāo)記量為10μL。試紙條組裝選擇玻璃纖維素膜VL68做為金標(biāo)墊,硝酸纖維素膜Sarteries CN 95作為NC膜。夾心法試紙條T線和C線用6μL,1mg/mL的β-LG-IgG和羊抗兔,可檢出牛乳最低摻入量為5%。競爭法β-LG的包被量與夾心法相同,牛乳最低檢出摻入量10%。雙聯(lián)法試紙條,在夾心法基礎(chǔ)上增加α-CN-IgG包被檢測線,可檢出的牛乳最低摻入量仍為5%。在市售樣本檢測中,雙聯(lián)試紙條可避免因β-LG變性引起的假陽性,結(jié)果更加穩(wěn)定。(3)牛β-LG單克隆抗體的制備及檢測應(yīng)用。牛β-LG免疫小鼠,取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,篩選出6株雜交瘤抗體分泌陽性細(xì)胞,分別為1B9、2D3、3A8、4G7、5E4和5F12,小鼠腹水制備單抗。其抗體效價(jià)均在1:10000以上,交叉反應(yīng)小,特異性高。膠體金標(biāo)記單抗后效價(jià)為1:1.28×10~5,用于建立夾心法免疫層析試紙條。優(yōu)化試驗(yàn)條件后,用6μL,0.5mg/mL的β-LG-IgG和二抗分別包被T線和C線,可檢出牛乳最低摻入量為2%,該試紙條的檢測限低,特異性高,檢測結(jié)果可靠穩(wěn)定。牛羊乳的β-LG結(jié)構(gòu)和免疫原性有差異,基于此建立免疫學(xué)檢測方法用于羊乳中摻入牛乳,基于單克隆抗體的夾心法免疫膠體金試紙條方法穩(wěn)定,檢測速度快,交叉反應(yīng)小,檢測限低,適用于大規(guī)模樣本的現(xiàn)場快速檢測。
【圖文】：

基于 β-乳球蛋白的牛羊乳區(qū)別檢測技術(shù)研究層析試紙條法以獲得最佳檢測效果，，此方法的建立應(yīng)對試紙條的 NC 膜，玻璃纖維素膜及金標(biāo)墊進(jìn)行處理，選擇最優(yōu)的條件進(jìn)行試紙條的組裝，測試試紙條的特異性，靈敏性等。將建立的膠體金免疫層析試紙條和建立的間接 ELISA 法運(yùn)用到實(shí)際樣品的檢測中。（3）最后，為了提高檢測的特異性，采用細(xì)胞工程技術(shù)制備單克隆抗體。對篩選得到的單克隆抗體的效價(jià)，特異性進(jìn)行檢測。并用于建立膠體金免疫層析試紙法檢測牛羊乳的摻假。1.5.2 技術(shù)路線本課題的研究技術(shù)路線見圖 1-4。

-乳球蛋白的分離制備乳作為最常見的營養(yǎng)來源，其主要蛋白分為酪蛋白、清蛋等三大類。酪蛋白和乳清蛋白是牛羊乳中主要的成分，酪。乳清蛋白包括 β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LGin，α-LA）以及乳白蛋白、乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）-LG 以二聚體的形式存在，有 A、B 兩種遺傳變體，在 離為單體，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)，羊乳 β-LG 的非變性電白質(zhì)的天然狀態(tài)下，存在較大差異，選擇 β-LG 為對象，檢測。等電點(diǎn)法牛羊乳分別在 pH4.6 和 pH 4.1 下離心沉淀酪蛋用檸檬酸法進(jìn)一步對牛羊乳清進(jìn)行分離，得到 β-LG，作的抗體免疫新西蘭大耳兔，制備獲得多克隆抗體并分離純
【學(xué)位授予單位】：陜西科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS252.7;O658.9

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本文編號：2621577