【摘要】：在貯藏過程中,馬鈴薯會因激素改變打破休眠期,同時伴隨著內(nèi)生毒素龍葵堿含量上升。在我國,由于馬鈴薯龍葵堿毒素而造成的產(chǎn)業(yè)損失高達15-20%。因此,降低塊莖毒素含量,減少產(chǎn)業(yè)損失顯得尤為重要。植物內(nèi)生菌和宿主植物經(jīng)過長時間的相互作用,形成了特有的基因特征和代謝產(chǎn)物。幾乎所有高等植物體內(nèi)均有內(nèi)生菌的存在,內(nèi)生菌可通過各種途徑,如產(chǎn)生植物激素、調(diào)控宿主基因表達和產(chǎn)生其它次級代謝產(chǎn)物,來影響宿主植物的代謝、生長、抗逆等生理活動。目前,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)開始使用植物內(nèi)生菌以減少無機肥料、除草劑、殺蟲劑和保鮮劑的使用,從而實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究以馬鈴薯內(nèi)生菌為切入點,研究其在塊莖毒素龍葵堿含量變化過程中的生物活性功能,以期尋找到具有降毒活性的內(nèi)生菌株,分析其活性組分化學成分,為進一步闡明抑毒作用機制奠定基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容如下:1.從馬鈴薯塊莖中分離得到38株內(nèi)生菌,其中30株放線菌分別屬于11個屬,包括鏈霉菌屬(Streptomyces)、微桿菌屬(Microbacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardioides)、谷氨酸棒桿菌屬(Glutamicibacter)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、壤霉菌屬(Agromyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、厄氏菌屬(Leucobacter)、原小單孢菌(Promicromonospora)和Paenarthrobacter屬;4株變形菌分別屬于4個屬,包括根瘤菌屬(Rhizobium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)和申氏菌屬(Shinella);4株厚壁菌分別屬于2個屬,包括芽孢桿菌屬(Bacillus)和賴氨酸芽胞桿菌屬(Lysinibacillus)。2.對上述內(nèi)生菌生物學活性進行分析。采用濾紙片擴散法,篩選得到9株對馬鈴薯黑脛病病原菌具有抑制作用的內(nèi)生菌,3株對馬鈴薯瘡痂病病原菌具有抑制作用的內(nèi)生菌,其中菌株GP5-2、HV18和NA2-14對兩種病原菌均具有抑制作用。38株內(nèi)生菌發(fā)酵液直接浸泡馬鈴薯10分鐘,貯藏7天后初篩發(fā)現(xiàn),內(nèi)生菌株NA2-14對龍葵堿抑制作用最佳,達38%,進行16S rRNA測序鑒定,鑒定為Bacillus megaterium。將其制成菌劑,經(jīng)模擬貯藏實驗發(fā)現(xiàn),貯藏時間越長抑制作用越明顯,該菌劑可降低貯藏期龍葵堿安全風險。3.菌株NA2-14發(fā)酵液不同活性組分處理馬鈴薯塊莖,28℃光照貯藏7天后,對塊莖內(nèi)生菌群進行免培養(yǎng)多樣性分析。塊莖內(nèi)生菌的主要門為Bacteroidetes、Firmicutes、Actinobateria和Proteobacteria。不同龍葵堿含量塊莖的內(nèi)生菌群的構(gòu)成存在顯著性差異,菌群豐度和種類變化較大,塊莖龍葵堿含量將對內(nèi)生菌群的構(gòu)成產(chǎn)生影響。同時,推測內(nèi)生菌群的多樣性變化可能影響其次級代謝產(chǎn)物的積累,進而對馬鈴薯龍葵堿含量產(chǎn)生不同的影響。4.將菌株NA2-14發(fā)酵液進行大孔樹脂分離提取,活性組分20-20和40-20對馬鈴薯塊莖龍葵堿具有較明顯的抑制作用。經(jīng)UPLC、UPLC-Q-TOF-MS分析,鑒定其主要化學物質(zhì)為三七皂苷R6和仙茅皂苷K。
【圖文】：

生促大米幼苗生長的內(nèi)生菌及其產(chǎn)生的植物激素類物質(zhì)（圖1.1）。部分內(nèi)生菌分泌的代謝產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)植物根部生理狀態(tài)，加快根部吸收營養(yǎng)成分的作用（Saravanan et al，2008）。一些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生和植物相同或相似的化合物：內(nèi)生菌輔助植物完成化合物的合成；內(nèi)生菌與宿主進行遺傳信息交換，擁有相似表達通路，從而合成相同產(chǎn)物。Verginer （ 2010 ）等對草莓內(nèi)生菌 Methylobacterium extorquens 進行研究，結(jié)果表明，Methylobacterium extorquens 體內(nèi)定植濃度越高其草莓芳香越濃烈；Methylobacterium extorquens體外培養(yǎng)時可以產(chǎn)生兩種草莓芳香物質(zhì)。甚至有研究表明，在宿主與內(nèi)生菌長期協(xié)同進化過程中，一些內(nèi)生菌與宿主之間存在基因水平上的相互影響（Hardoim et al.，2015）。Passari（2016）等從

龍葵堿還具有抗腫瘤、抗病原菌等作用。小鼠實驗證明，龍葵堿能夠明顯抑制其腫瘤細胞流達到延長 H22 荷瘤小鼠生存時間的目的。體外實驗證明，龍葵堿對人體肝癌 HeGZ 細胞、人癌 HeLa 細胞、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤 u251 細胞、人前列腺癌 Pc-3 細胞和黑色素瘤 A2058 細胞均具制作用（Lv et al.，2014； Shiro et al.，2013）。龍葵堿還具有消炎、增強血液流通、消淤散作用（馬美麗，2003），以及保護肝臟、腎臟的作用（Liu et al，2004；鄭岳等，2016）。在農(nóng)產(chǎn)上，龍葵堿對病原菌具有抑制作用、對病蟲害具有驅(qū)抗性以及培育抗病蟲新品種（李紅梅2005）。由此可知，龍葵堿不僅具有毒性作用，在醫(yī)學、農(nóng)業(yè)上均有廣闊的潛在應(yīng)用價值。.2 龍葵堿的合成路徑龍葵堿在馬鈴薯中的合成路徑的相關(guān)研究仍在進行中，已知主要合成路徑如圖 1.3 所示。主為三個部分：第一部分是通過甲醛戊酸途徑形成萜烯類，第二部分是合成膽固醇，第三部分膽固醇合成茄堿的糖配基，也就是茄啶。其中，從乙酰輔酶 A 到合成膽固醇環(huán)節(jié)是多數(shù)植物存在的表達通路，而由膽固醇生成茄啶，再由茄啶生成茄堿和卡茄堿則是茄科類植物中特有謝路徑（Ginzberg et al.，2009），，但是有關(guān)由膽固醇合成茄啶路徑中的相關(guān)調(diào)控基因和酶類究尚不清晰�？ㄇ褖AChaconine茄堿Solanine
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TS215

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本文編號：2621406