【摘要】：近年來,隨著社會的發(fā)展,肉及肉類產(chǎn)品摻假現(xiàn)象日益突出。在中國,由于羊肉卷及羊肉串深受人們的喜愛。因此,羊肉摻假成為一些不法商販謀取利潤的手段,主要摻假現(xiàn)象是將價格低廉的鴨肉、豬肉及雞肉摻入到價格昂貴的羊肉中,“掛狗頭賣羊肉”的現(xiàn)象屢見不鮮。2013年,歐洲馬肉風(fēng)波事件引起了世界的關(guān)注,也引起了相關(guān)部門的重視。目前羊肉摻假的檢測方法主要以核酸PCR檢測為主,均為定性檢測;近年來發(fā)展的數(shù)字PCR雖然可以對羊肉摻假進行定量檢測,但需要昂貴的試劑及專業(yè)的操作技能,實驗室檢測所需時間較長,因此急需開發(fā)一種簡單快速的羊肉摻假鑒別定量檢測方法。本文研究了一種DNA快速提取液;建立了基于線粒體和核單拷貝基因的羊肉摻假PCR定量檢測方法;開發(fā)了基于重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)(Recombinase polymerase amplification,RPA)的羊肉快速鑒定試紙條。主要內(nèi)容如下:(1)研究了不同的提取液對肉類DNA的提取效果,優(yōu)化提取時間及濃度,通過比較,提取效果最佳的為NaOH提取液。該提取液可在5 min內(nèi)完成對肉類DNA的提取,無需研磨、離心等步驟,配制簡單,成本低,保存時間久。該提取液的研究為羊肉摻假快速檢測方法的建立提供了先行條件。(2)基于羊線粒體基因篩選通用和羊源特異性引物,建立對羊肉產(chǎn)品中羊肉含量定量檢測的PCR方法。將不同質(zhì)量的羊肉與豬肉進行混合制備標(biāo)準(zhǔn)樣品,根據(jù)羊肉所占比例與Ct比值(羊源特異性引物對標(biāo)準(zhǔn)樣品擴增Ct值/通用引物對標(biāo)準(zhǔn)樣品擴增Ct值)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為Y=-0.3166X+1.2113,線性關(guān)系良好(R~2=0.9929)。通過對模擬樣品進行檢測,平均回收率為108.74%。表明該方法可以用于羊豬混合樣品的定量摻假檢測。(3)基于核單拷貝基因查找并篩選通用與羊源特異性引物,建立了快速定量檢測羊肉摻假的熒光定量PCR方法。利用內(nèi)參基因校正羊源種屬特異基因的含量,根據(jù)初始模板濃度的對數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液PCR擴增的Ct值建立內(nèi)參基因與羊源性特異基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程分別為Y=-3.9416X+27.954和Y=-3.5507X+28.844,相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.9999與R2=0.9993。通過對模擬樣品進行檢測和計算,羊豬、羊鴨與羊雞混合樣品回收率分別為89.317%、95.11%和107.15%。該方法可以在3 h之內(nèi)完成羊源性成分含量的鑒定工作,具有簡單快速、靈敏度高、特異性好、成本低且便于推廣等特點,為動物源性成分摻假量化檢測提供了廣闊的前景。(4)利用納米金材料,研發(fā)了一種基于RPA可肉眼檢測羊肉成分的膠體金試紙條。該方法可對羊肉成分進行定性檢測,檢測濃度范圍為20 ng/μL-2 pg/μL,檢測時間為30 min,檢測結(jié)果肉眼可見。該方法操作簡單、靈敏快速,對動物源性成分的現(xiàn)場檢測具有重要意義。
【圖文】：

鄩崛?DNA 稀釋 10 倍與未稀釋作為模板進行 RPA 擴增, 觀察結(jié)果如圖2.2。圖 2.2 提取液條件優(yōu)化Fig 2. 2 Condition optimization of lysate注: 1、2、3 為 NaOH 提取液提取 1、3、5 min(稀釋 10 倍為模板); 4、5、6 為 PBS 提取液提取 1、3、5 min(稀釋 10 倍為模板); 8、9、10 為 NaOH 提取液提取 1、3、5 min(原液為模板); 11、12、13 為 PBS 提取液提取 1、3、5 min(原液為模板); 7、14 為空白對照。M 為 600 bp。從圖 2.2 可以看出，NaOH 提取液提取 DNA 在稀釋 10 倍作為模板時，在 1、3 與 5min沒有太大差別，PBS 提取液在 3 min 時擴增效率最好。對比稀釋與未稀釋的模板 DNA，結(jié)果表明，NaOH 提取液稀釋后的擴增效率高于未稀釋的，PBS 提取液在未稀釋情況下沒有擴增，，結(jié)論是稀釋后擴增效率較高, 可能原因是提取液成分會抑制 RPA 擴增, 對比結(jié)果，選擇NaOH 提取液

否稀釋對 RPA 擴增的影響中只有 2 種提取液提取的 DNA 可以滿足 RPA 要求行不同時間與是否稀釋實驗。對羊肉提取 1、3 與提取 DNA 稀釋 10 倍與未稀釋作為模板進行 RPA 圖 2.2 提取液條件優(yōu)化Fig 2. 2 Condition optimization of lysate圖 2.1 不同提取液 RPA 擴增結(jié)果Fig 2. 1 RPA amplification with different extraction solution為 NaOH 提取液、Chelex 提取液與 PBS 提取液；2、4、6 為空白對照；
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TS251.53;O652

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本文編號：2615370