為了構(gòu)建生長(zhǎng)快、培養(yǎng)簡(jiǎn)便的高產(chǎn)衣康酸工程菌,在表達(dá)編碼順烏頭酸脫羧酶的cad基因基礎(chǔ)上,過(guò)表達(dá)編碼檸檬酸合酶的glt基因,所得重組菌株搖瓶發(fā)酵24 h產(chǎn)生104 mg/L的衣康酸。通過(guò)進(jìn)一步表達(dá)ACS基因構(gòu)建乙酸回補(bǔ)途徑,衣康酸含量達(dá)到128 mg/L,提高17%。外源添加檸檬酸鈉和順烏頭酸對(duì)衣康酸的合成有明顯的促進(jìn)作用。共表達(dá)cad、glt和ACS的工程菌在IPTG誘導(dǎo)后0 h加入12 g/L檸檬酸鈉,18℃搖瓶培養(yǎng)24 h,衣康酸的產(chǎn)量達(dá)到317 mg/L,檸檬酸鹽的利用率達(dá)到66%,發(fā)酵液中僅有少量的乙酸(0.579 g/L)積累。研究結(jié)果表明:通過(guò)衣康酸合成代謝途徑的強(qiáng)化和衣康酸前體的適當(dāng)供給可以有效提高大腸桿菌生產(chǎn)衣康酸的能力。

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圖25種工程菌的衣康酸含量與生物量直方圖

大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的原核模式生物，已發(fā)展出多種不同基因型和用途的表達(dá)宿主。為了尋找外源基因cad的最佳表達(dá)宿主，分別將質(zhì)粒pET-22b-cad轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21、Rosetta、OrigamiB、JM109和MG1655。重組菌株于37℃和200r/min培養(yǎng)后，....

圖1大腸桿菌中生產(chǎn)衣康酸代謝圖

衣康酸目前主要通過(guò)土曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)。在土曲霉發(fā)酵中，由順烏頭酸脫羧酶(Cis-aconitatedecarboxylase,Cad)催化順烏頭酸(Cis-aconitate)生成衣康酸(Itaconate)。土曲霉發(fā)酵具有原料價(jià)格低、發(fā)酵易控制、無(wú)毒副產(chǎn)物產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)，但是存在菌....

圖3過(guò)表達(dá)glt和acn對(duì)衣康酸含量(a)和生物量(b)的影響

順烏頭酸既是衣康酸合成的底物，又是TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物，其在細(xì)胞中的含量對(duì)衣康酸的產(chǎn)量影響甚大。為了提高衣康酸的產(chǎn)量，本研究對(duì)檸檬酸和順烏頭酸(衣康酸合成的兩個(gè)前體)的生物合成進(jìn)行了強(qiáng)化，通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼檸檬酸合酶的glt基因和編碼烏頭酸酶的acn基因提高檸檬酸和順烏頭酸的生成量。....

圖4工程菌的乙酸含量(a)及表達(dá)ACS對(duì)乙酸含量(b)、衣康酸含量(c)和生物量(d)的影響

通過(guò)工程菌產(chǎn)物的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的乙酸含量較高，表明細(xì)胞碳源損失嚴(yán)重，影響了衣康酸的合成(圖4(a))。為挽回?fù)p失的碳源，同時(shí)改善細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境，在工程菌中引入了乙酸回補(bǔ)途徑。通過(guò)表達(dá)編碼乙酰輔酶A合成酶的ACS基因，工程菌中乙酸含量明顯下降，24h時(shí)乙酸含量?jī)H為0.857....

本文編號(hào)：3941249