發(fā)布時間：2024-02-18 06:04

　　巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)作為目前應用最為廣泛的真核微生物表達宿主細胞之一,與其它表達系統相比,P.pastoris表達系統最顯著的優(yōu)勢在其具有嚴格受甲醇誘導的誘導型強啟動子-啟動醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)啟動子(promoter of alcohol oxidase 1,PAOX1),研究發(fā)現,該啟動子只有在甲醇作為唯一碳源時才發(fā)揮功能,當甘油或葡萄糖等碳源存在時,PAOX1受到嚴重抑制。通過對其誘導機制研究發(fā)現,甲醇代謝調控因子1(methanol expression regulator 1,MXR1)是PAOX1發(fā)揮啟動功能所必須的。目前關于MXR1如何調控PAOX1的機制研究尚不是很清楚,本文通過研究MXR1激活AOX1轉錄機理,揭示甲醇誘導,甘油阻遏AOX1轉錄機理。首先通過PULL-DOWN找到與P.pastoris MXR1相互作用的一個蛋白—酪氨酸磷酸酶(Protein phosphotyrosine phosphatase,PTP)。該蛋白在甲醇培養(yǎng)基中與MXR1相互作用,并通過體外實驗驗證...

【文章頁數】：56 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖3-1MXR1PULL-DOWN結果及PTP條帶Figure3-1MXR1PULL-DOWNresultsandPTPstrips

圖3-1MXR1PULL-DOWN結果及PTP條帶gure3-1MXR1PULL-DOWNresultsandPTPst115總蛋白；2：在甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)的GS115總鑒定與MXR1相互作用的蛋白其中有磷酸酶P能驗證蘇州金唯智密碼子優(yōu)化然后連....

圖3-2PTP異源表達Westernblot驗證圖

15蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互通過SDS-PAGE電泳，切膠，經過質譜分圖3-1MXR1PULL-DOWN結果及PTP條帶gure3-1MXR1PULL-DOWNresultsandPTPs115總蛋白；2：在甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)的GS115....

圖3-3PTP外原表達及功能驗證Figure3-3PTPforeignaidexpressionandfunctionverification

第三章結果與討論記的兔抗二抗1h，PBST洗板5遍，加多功能酶標儀檢測結果。酶促反應結束后MXR1磷酸化多肽剩余量酸化抗原多肽，或非磷酸化抗原多肽，孵000)，通過加入純化的PTP蛋白和只加入，發(fā)現加入PTP的樣品幾乎沒有磷酸化抗酸化的蛋白活性，可以將M....

圖3-5磷酸酶PTP最適溫度Figure3-5OptimumtemperatureofphosphatasePTP

經過BCA法測得蛋白濃度是0.98mg/L，以相同濃度pNPP為底物，相同體積酶在不同的溫度反應，10min，1mol/L硫酸鈉終止反應，405nm測吸光強度，最適酶促反應溫度41℃(圖3-5)。圖3-5磷酸酶PTP最適溫度Figure3-5Optimumtemper....

本文編號：3902032