L-丙氨酸在醫(yī)藥及保健品、日化、食品及食品添加劑等行業(yè)有廣泛的應用,因此,L-丙氨酸的高產(chǎn)菌株是市場迫切需要的。本實驗室前期成功構建了丙氨酸產(chǎn)生菌MG1655-31(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaD),測得其L-丙氨酸產(chǎn)量高于野生型,這為本研究提供了研究依據(jù)。本研究以菌株MG1655-31作為出發(fā)菌株,利用CRISPR/Cas9技術,在染色體水平進行基因敲除與敲入,通過阻斷其它競爭代謝途徑、過表達外源高活性關鍵酶和丙氨酸外運蛋白等策略,初步構建了L-丙氨酸產(chǎn)生菌。結果顯示:(1)CRISPR/Cas9作為一種廣泛應用的基因編輯工具,能夠對大腸桿菌基因組進行簡便、高效、多位點的基因敲除與敲入;(2)多輪基因編輯得到的大腸桿菌菌株MG655-714(ΔldhAΔpflBΔdadX::alaDΔfr dA::alaDΔadhE::alaEΔackA-pta)經(jīng)22h搖瓶厭氧發(fā)酵L-丙氨酸產(chǎn)量由5.54mg/mL提升至15.01mg/mL;5L發(fā)酵罐48h厭氧發(fā)酵L-丙氨酸產(chǎn)量由7.37mg/mL提升至20.01mg/mL;(3)分別提取發(fā)酵過程中不同時間點的大腸桿菌K-12野生型菌...

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-4PCR結果

第二章大腸桿菌L-丙氨酸產(chǎn)生菌的構建19MMarker;A1-A4upHomologousarm;A5-A7alaD基因;B8-B11downHomologousarm;C12-C15上游同源臂與alaD連接;D16-D18DonorDNA;E19-E20pTargetF-sgR....

圖2-5PCR結果

河北大學碩士學位論文20氨酸代謝相關途徑中，frdA（延胡索酸還原酶基因）參與琥珀酸的合成，敲除frdA阻礙了琥珀酸的生物合成；丙酮酸在來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶（alaD）的作用下，進一步代謝生成L-丙氨酸。所以，敲除frdA同時敲入alaD有助于提高L-丙氨酸的產(chǎn)量....

圖2-6PCR結果

河北大學碩士學位論文22MMarker;A1-A4upHomologousarm;A5-A8downHomologousarm;B9-B12DonorDNA;C13-C16pTargetF-sgRNA-ackA-pta;D1-D2野生型對照;D3-D5陽性克隆.2.5.6菌落PC....

圖4-21RNA電泳圖

第四章基因編輯菌株與野生型菌株轉錄組分析35MRNAMarker;1-3菌株E.coliK-12MG1655；4-6菌株MG1655-714RNA樣品按照轉錄流程測序之后，將兩菌株的轉錄文本數(shù)據(jù)進行整理、與參考基因組對比分析以及進行表達量分析之后，為篩選出差異基因，繼續(xù)進行如下分....

本文編號：3890782