發(fā)布時間：2023-10-30 20:40

　　左旋多巴(3,4-2dihydroxylphenylalanine,L-DOPA)是治療帕金森綜合癥的主要藥物,隨著我國人口老齡化速度的加快,對左旋多巴的需求也迅速增加。目前應用于工業(yè)化生產(chǎn)L-DOPA的方法主有化學合成和微生物酶催化法�；瘜W合成法雖然具有純度高和收率高的優(yōu)勢,但也存在步驟繁雜、環(huán)境污染嚴重、成本較高等問題;微生物酶催化法具有工藝簡單、產(chǎn)量穩(wěn)定、條件溫和等優(yōu)點,具有廣闊的工業(yè)化應用前景。原始菌株(如Erwinia herbicola等)中的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol-lyase,TPL)活性普遍較低,無法直接用于高效催化合成L-DOPA。為了提高酪氨酸酚裂解酶表達量與酶活,本研究在大腸桿菌(Escherichia coli)中異源表達來源于草生歐文式菌(Erwinia herbicola)的TPL,通過易錯PCR技術對酪氨酸酚裂解酶基因進行定向進化,并分別在搖瓶和5 L發(fā)酵罐水平上對重組菌的培養(yǎng)條件以及催化合成L-DOPA的條件進行了優(yōu)化,提高了酪氨酸酚裂解酶的催化效率和L-DOPA的產(chǎn)量。論文主要研究結果如下:(1)結合易錯PCR和高通量篩選技術定...

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 左旋多巴
        1.1.1 左旋多巴的概述
        1.1.2 左旋多巴的合成
    1.2 酪氨酸酚裂解酶
        1.2.1 酪氨酸酚裂解酶簡介
        1.2.2 酪氨酸酚裂解酶催化機理
        1.2.3 酪氨酸酚裂解酶的應用現(xiàn)狀
    1.3 立題依據(jù)與研究內容
        1.3.1 立題依據(jù)
        1.3.2 研究內容
第二章 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質粒
        2.1.2 主要培養(yǎng)基
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要溶液
        2.1.5 主要儀器
    2.2 分子生物學操作
        2.2.1 易錯PCR
        2.2.2 PCR產(chǎn)物的純化回收
        2.2.3 突變PCR產(chǎn)物的連接與重組質粒的轉化
        2.2.4 陽性轉化子的鑒定
    2.3 培養(yǎng)方法
        2.3.1 菌種培養(yǎng)及全細胞催化劑的制備
        2.3.2 全細胞催化合成L-DOPA
        2.3.3 重組大腸桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化
        2.3.4 重組大腸桿菌誘導條件優(yōu)化
        2.3.5 全細胞催化條件優(yōu)化
    2.4 純化與分析方法
        2.4.1 酶的純化
        2.4.2 蛋白濃度及酶活測定
        2.4.3 TPL酶學性質的測定
        2.4.4 菌體濃度測定
        2.4.5 L-DOPA液相檢測方法
        2.4.6 甘油檢測方法
        2.4.7 高通量篩選方法
第三章 結果與討論
    3.1 易錯PCR反應體系建立及TPL基因突變庫的構建
        3.1.1 易錯PCR條件的優(yōu)化
        3.1.2 TPL基因突變體庫的構建與篩選
        3.1.3 突變TPL(突變株3-2F9)的表達與純化
        3.1.4 突變酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性
        3.1.5 突變酶的最適pH和 pH穩(wěn)定性
        3.1.6 突變酶的動力學參數(shù)測定及突變位點分析
    3.2 搖瓶水平上發(fā)酵生產(chǎn)TPL及催化合成L-DOPA的條件優(yōu)化
        3.2.1 重組E.coli BL21 的培養(yǎng)條件優(yōu)化
        3.2.2 重組E.coli BL21 產(chǎn)酶條件優(yōu)化
        3.2.3 L-DOPA合成條件的優(yōu)化
    3.3 重組大腸桿菌在5 L罐上生產(chǎn)L-DOPA的高密度發(fā)酵研究
        3.3.1 重組大腸桿菌的分批發(fā)酵
        3.3.2 攪拌轉速對酪氨酸酚裂解酶分批發(fā)酵的影響
        3.3.3 DO-Stat流加控制培養(yǎng)
        3.3.4 誘導起始時間的優(yōu)化
        3.3.5 底物流加方式的優(yōu)化
結論與展望
    主要結論
    展望
致謝
參考文獻
附錄 :作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3859153