本研究以谷氨酸棒狀桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032為研究對象,通過代謝工程策略構(gòu)建了高產(chǎn)L-蘋果酸菌株,并結(jié)合啟動子工程策略強化了磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸合成草酰乙酸的羧化途徑,進一步提高了L-蘋果酸產(chǎn)量。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建L-蘋果酸生產(chǎn)菌株。利用質(zhì)粒pK19mobsacB建立了同源重組法敲除谷氨酸棒狀桿菌基因的方法,通過連續(xù)敲除磷酸乙�；D(zhuǎn)移酶-乙酸激酶編碼基因pta-ack,乳酸脫氫酶編碼基因ldh,丙酮酸醌氧化還原酶編碼基因pqo和蘋果酸酶編碼基因male,阻斷了丙酮酸合成乙酸和乳酸的代謝路徑以及L-蘋果酸回補丙酮酸路徑,成功構(gòu)建了L-蘋果酸生產(chǎn)菌株A04。菌株A04經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)后可生產(chǎn)L-蘋果酸7.448 g/L、丙酮酸6.704 g/L。(2)強化羧化途徑提高L-蘋果酸產(chǎn)量。通過替換自身強啟動子Psod來過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因ppc和丙酮酸羧化酶編碼基因pyc,強化L-蘋果酸合成路徑中的羧化途徑,提高流向L-蘋果酸的碳通量,進一步提高菌株生產(chǎn)L-蘋果酸的能力。最終,在初步優(yōu)化的發(fā)酵實驗條件下,L-蘋果酸最大...

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 蘋果酸概述
        1.1.1 蘋果酸的性質(zhì)
        1.1.2 蘋果酸的應用
    1.2 L-蘋果酸的生產(chǎn)方法
        1.2.1 直接提取法
        1.2.2 化學合成法
        1.2.3 酶轉(zhuǎn)化或細胞轉(zhuǎn)化法
        1.2.4 生物發(fā)酵法
    1.3 谷氨酸棒狀桿菌研究現(xiàn)狀
        1.3.1 谷氨酸棒狀桿菌簡介
        1.3.2 谷氨酸棒狀桿菌研究現(xiàn)狀
        1.3.3 谷氨酸棒狀桿菌中L-蘋果酸代謝路徑分析
    1.4 本課題研究意義和內(nèi)容
第二章 產(chǎn)L-蘋果酸重組谷氨酸棒狀桿菌的構(gòu)建
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物
        2.1.2 常用儀器和試劑
        2.1.3 培養(yǎng)基和主要溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 谷氨酸棒狀桿菌基因組的提取
        2.2.2 大腸桿菌中質(zhì)粒的提取
        2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳
        2.2.4 瓊脂糖凝膠回收方法
        2.2.5 質(zhì)粒和DNA雙酶切及酶切產(chǎn)物連接方法
        2.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和熱激轉(zhuǎn)化方法
        2.2.7 谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備和電轉(zhuǎn)化方法
        2.2.8 谷氨酸棒狀桿菌基因敲除方法
    2.3 結(jié)果與討論
    2.4 小結(jié)
第三章 基因敲除和過表達對谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)L-蘋果酸的影響
    3.1 實驗材料
        3.1.1 主要儀器和試劑
        3.1.2 培養(yǎng)基和主要溶液配制
    3.2
        3.2.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶酶活測定
        3.2.2 各菌株菌體密度的測定
        3.2.3 發(fā)酵液中葡萄糖濃度的測定
        3.2.4 有機酸的測定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 ppc和 pyc酶活分析
        3.3.2 代謝工程改造對菌株生長情況的影響
        3.3.3 工程菌積累有機酸的分析
    3.4 小結(jié)
第四章 總結(jié)與展望
    4.1 總結(jié)
    4.2 展望
致謝
參考文獻
附錄1 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3857963