偏甘油酯脂肪酶(mono-and di-acylglycerol lipase(DGL))在油脂和化工行業(yè)中具有重要應(yīng)用價值。但是,目前報道的DGL都屬于中溫酶,嚴(yán)重限制了其工業(yè)應(yīng)用,需要對其熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造。本論文以偏甘油酯脂肪酶SMG1和PCL為研究對象,通過計算生物學(xué)方法開展熱穩(wěn)定性改造。具體包括以下幾個方面的內(nèi)容:1.運用計算機輔助設(shè)計對脂肪酶SMG1的熱穩(wěn)定性研究。運用三種軟件RosettaDesign、FoldX和ABACUS對SMG1進(jìn)行熱穩(wěn)定性突變設(shè)計,最后得到18個Tm值提高的單點突變;將上述18個單點突變位點疊加組合,得到最佳突變體S5(Q34P+A37P+M176V+G177A+M294R),其Tm值提升6℃,最適溫度提高5℃;在S5的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了二輪設(shè)計,得到Tm值提升6℃的單點Q282F,酶活性測定發(fā)現(xiàn)該突變體對酶活性影響顯著,基于結(jié)構(gòu)分析,可知突變后的氨基酸位點形成空間位阻,并且與F278形成的π-π相互作用也會造成空間位阻。2.氨基酸替換結(jié)合結(jié)構(gòu)分析對脂肪酶PCL的熱穩(wěn)定性改造�；谟嬎闵飳W(xué)方法獲得的微生物熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成特征,通過將脂肪酶PC...

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號表
第一章 緒論
    1.1 熱穩(wěn)定性酶概述
        1.1.1 酶熱穩(wěn)定性的定義及其常用表示方法
        1.1.2 熱穩(wěn)定性酶的應(yīng)用
        1.1.3 影響酶熱穩(wěn)定性的因素
    1.2 酶分子熱穩(wěn)定性改造策略
        1.2.1 非理性設(shè)計
        1.2.2 理性設(shè)計
        1.2.3 半理性設(shè)計
    1.3 偏甘油酯脂肪酶
        1.3.1 偏甘油酯脂肪酶SMG
        1.3.2 偏甘油酯脂肪酶PCL
    1.4 本課題研究意義和主要內(nèi)容
第二章 計算機設(shè)計SMG1熱穩(wěn)定性突變體
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 培養(yǎng)基及溶液配制
        2.2.3 引物合成與DNA測序
        2.2.4 主要儀器
        2.2.5 計算分析軟件
    2.3 突變體設(shè)計與構(gòu)建
        2.3.1 突變體設(shè)計
        2.3.2 突變體構(gòu)建
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 Rosetta計算后篩選得到的有益突變體
        2.4.2 FoldX計算篩選后得到的有益突變體
        2.4.3 ABACUS計算篩選后得到的有益突變體
        2.4.4 結(jié)構(gòu)上合理位點
    2.5 本章小結(jié)
第三章 SMG1突變體表達(dá)純化和熱穩(wěn)定性分析
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 表達(dá)菌株
        3.2.2 培養(yǎng)基
    3.3 實驗方法
        3.3.1 突變質(zhì)粒和表達(dá)菌株構(gòu)建
        3.3.2 SMG1和突變體蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 菌液處理
        3.3.4 目的蛋白純化和熱穩(wěn)定性檢測
    3.4 疊加突變體構(gòu)建與熱穩(wěn)定性檢測
        3.4.1 疊加突變體構(gòu)建
        3.4.2 疊加突變體表達(dá)純化及熱穩(wěn)定性檢測
    3.5 疊加突變體酶活性及酶學(xué)性質(zhì)檢測
    3.6 二輪計算機設(shè)計突變體
    3.7 實驗結(jié)果
        3.7.1 突變體蛋白表達(dá)情況匯總
        3.7.2 突變體Tm值測定結(jié)果匯總
        3.7.3 疊加突變體構(gòu)建路線和表達(dá)情況
        3.7.4 疊加突變體熱穩(wěn)定性及酶學(xué)性質(zhì)測定
        3.7.5 二輪計算篩選突變體
        3.7.6 二輪計算突變體構(gòu)建、表達(dá)及熱穩(wěn)定性測定
        3.7.7 最優(yōu)突變體酶活性測定
    3.8 本章小結(jié)
第四章 氨基酸替換結(jié)合結(jié)構(gòu)分析對PCL熱穩(wěn)定性改造
    4.1 引言
    4.2 突變體設(shè)計思路
    4.3 實驗方法
        4.3.1 突變體構(gòu)建
        4.3.2 突變體表達(dá)和純化
    4.4 活性檢測、熱穩(wěn)定性評估及其它酶學(xué)性質(zhì)測定
        4.4.1 滴定法測定酶活
        4.4.2 熱穩(wěn)定評估
        4.4.3 PCL與突變體生化性質(zhì)測定
        4.4.4 Km、Kcat值測定
    4.5 動力學(xué)（MD）分析熱穩(wěn)定性
    4.6 實驗結(jié)果
        4.6.1 突變體設(shè)計結(jié)果
        4.6.2 突變體純化結(jié)果
        4.6.3 Tm值和T1/2值測定結(jié)果
        4.6.4 生化性質(zhì)測定
        4.6.5 Km、Kcat值測定結(jié)果
        4.6.6 動力學(xué)結(jié)果分析
    4.7 本章小結(jié)
第五章 兩種熱穩(wěn)定性改造方法總結(jié)和比較
    5.1 引言
    5.2 兩種熱穩(wěn)定性改造方法總結(jié)
        5.2.1 計算機結(jié)合結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性設(shè)計
        5.2.2 氨基酸替換結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性設(shè)計
        5.2.3 兩種酶熱穩(wěn)定性方法比較
    5.3 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件



本文編號：3810049