真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物是新藥和先導(dǎo)化合物的重要來源,然而隨著越來越多的化合物被重復(fù)發(fā)現(xiàn),真菌來源的天然產(chǎn)物發(fā)掘逐漸到了瓶頸期。與分散在整個(gè)真菌基因組中的初級(jí)代謝物合成所需的基因相反,編碼活性酶以產(chǎn)生次級(jí)代謝物的基因常以連續(xù)的方式排列為生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的成熟和生物信息學(xué)分析方法的完善,研究人員發(fā)現(xiàn)真菌的BGCs十分豐富,然而由于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件的限制,超過70%的生物合成基因簇處于沉默或未開發(fā)狀態(tài),表明真菌天然產(chǎn)物的發(fā)掘還有很大的空間。因此,如何激活這些沉默基因簇成為真菌天然產(chǎn)物研究的關(guān)鍵。本文選擇絲狀真菌海生哈茨木霉Trichoderma harzianum LZDX-32-08 為研究對(duì)象,利用構(gòu)巢曲霉Aspergillus nzdulans A1145 及 LO8030 作為異源表達(dá)宿主,對(duì) T.harzianum LZDX-32-08中沉默或低表達(dá)的生物合成基因簇進(jìn)行探究。本文通過在A.nidulans A1145及LO8030中構(gòu)建異源表達(dá)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)空質(zhì)粒pQFl(含AMA1序列)的引入使得構(gòu)巢曲霉的...

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞與符號(hào)說明
第一章 緒論
    1.1 真菌來源天然產(chǎn)物的發(fā)展及現(xiàn)狀
        1.1.1 重要真菌活性天然產(chǎn)物類型及基因簇
            1.1.1.1 聚酮類
            1.1.1.2 萜類
            1.1.1.3 非核糖體多肽類
        1.1.2 核苷類化合物蟲草素的發(fā)展及現(xiàn)狀
    1.2 哈茨木霉的研究現(xiàn)狀
        1.2.1 哈茨木霉的生物防治功能
        1.2.2 哈茨木霉的天然產(chǎn)物研究
    1.3 異源表達(dá)體系在真菌天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用
        1.3.1 異源表達(dá)激活沉默基因(簇)的策略
        1.3.2 酵母組裝技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.3.3 質(zhì)粒構(gòu)建中AMA1序列的使用
    1.4. 本課題的研究目的及意義
第二章 哈茨木霉聚酮類及萜類天然產(chǎn)物生物合成基因簇的研究
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        2.2.1 菌株
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 全基因組測(cè)序
        2.3.2 反轉(zhuǎn)錄PCR
            2.3.2.1 RNA的提取
            2.3.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA
            2.3.2.3 PCR驗(yàn)證
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 Trichoderma harzianum生物合成基因簇的預(yù)測(cè)及分析
        2.4.2 海生T.harzianum LZDX-32-08基因組測(cè)序結(jié)果的分析
        2.4.3 驗(yàn)證目標(biāo)產(chǎn)物在初始菌株海生T.harzianum中的表達(dá)
            2.4.3.1 基因簇核心基因在菌株中的表達(dá)情況
            2.4.3.2 發(fā)酵結(jié)果驗(yàn)證兩個(gè)基因簇的沉默
    2.5 小結(jié)
第三章 空白質(zhì)粒對(duì)構(gòu)巢曲霉合成蟲草素的影響
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        3.2.1 質(zhì)粒及菌株
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 溶液及培養(yǎng)基配制
        3.3.2 Aspergillus nidulans原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化
        3.3.3 初始菌株及轉(zhuǎn)化子基因組(gDNA)提取
        3.3.4 產(chǎn)物的分離與鑒定
            3.3.4.1 硅膠柱層析
            3.3.4.2 半制備液相色譜分離
            3.3.4.3 核磁共振(NMR)
            3.3.4.4 UPLC及LC-MS檢測(cè)
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 Aspergillus nidulans空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的構(gòu)建
        3.4.2 蟲草素結(jié)構(gòu)的鑒定
        3.4.3 蟲草素合成基因的表達(dá)驗(yàn)證
        3.4.4 蟲草素合成的時(shí)間依賴性
        3.4.5 空白質(zhì)粒對(duì)蟲草素產(chǎn)量的提高
    3.5 小結(jié)
第四章 生物合成基因簇異源表達(dá)菌株的構(gòu)建
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        4.2.1 質(zhì)粒及菌株
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 PCR體系、條件及產(chǎn)物純化
        4.3.2 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子構(gòu)建及篩選
        4.3.3 培養(yǎng)基配制
        4.3.4 大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
        4.3.5 質(zhì)粒提取及限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證
        4.3.6 原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證
            4.4.4.1 PKS cluster8基因片段的克隆
            4.4.4.2 terpene cluster26基因片段的克隆
            4.4.4.3 質(zhì)粒的驗(yàn)證和線性化
            4.4.4.4 酵母轉(zhuǎn)化子篩選結(jié)果
            4.4.4.5 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證結(jié)果
        4.4.2 A.nidulans A1145構(gòu)巢曲霉異源表達(dá)菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證
            4.4.2.1 A1145轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
            4.4.2.2 RT-PCR驗(yàn)證
        4.4.3 A.nidulans L08030構(gòu)巢曲霉異源表達(dá)菌株的驗(yàn)證
    4.5 小結(jié)
第五章 異源表達(dá)產(chǎn)物的激活
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
        5.2.1 菌株
        5.2.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
        5.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配置
        5.3.2 孢子收集及發(fā)酵接種
        5.3.3 UPLC樣品準(zhǔn)備
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 探究A.nidulans A1145及L08030 PKS C8轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)條件
            5.4.1.1 A.nidulans A1145 PKS轉(zhuǎn)化子PM13培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果
            5.4.1.2 A.nidulans A1145 PKS轉(zhuǎn)化子PM14培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果
            5.4.1.3 A.nidulans L08030 PKS轉(zhuǎn)化子CD-ST培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果
        5.4.2 探究A.nidulans A1145及L08030 terpene C26轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)條件
            5.4.2.1 A.nidulans A1145及terpene轉(zhuǎn)化子PM13培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果
            5.4.2.2 A.nidulans A1145及terpene轉(zhuǎn)化子CD-ST培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果
            5.4.2.3 A.nidulans L08030及terpene轉(zhuǎn)化子CD-ST培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果
    5.5 小結(jié)
第六章 結(jié)論與建議
    6.1 結(jié)論
    6.2 研究特色及創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 建議
參考文獻(xiàn)
附錄
    1. 系統(tǒng)發(fā)生樹
    2. 引物列表
    3. 核磁圖譜
    4. LC-MS圖譜
致謝
研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
作者及導(dǎo)師簡介
附件



本文編號(hào)：3769331