基礎(chǔ)胰島素及類似藥物的臨床應(yīng)用使糖尿病患者整體血糖得到了有效的控制。但因其作用時(shí)間短、穩(wěn)定性差,以及依從性差等問題,促使研究者去開發(fā)一種作用平穩(wěn)而持久、體內(nèi)藥效變異性小,副作用更小的新型胰島素。德谷胰島素即為這類新型胰島素中的一種。本論文旨在構(gòu)建重組德谷胰島素前體蛋白的表達(dá)系統(tǒng),并著重將其發(fā)酵工藝從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到中試規(guī)模,為實(shí)現(xiàn)德谷胰島素的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。將人工合成的人胰島素前體基因INS和HS631質(zhì)粒連接為重組質(zhì)粒HS631-INS,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）內(nèi),構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)德谷胰島素前體蛋白的重組工程菌HS631-INS/BL21。酶切圖譜和測序結(jié)果顯示:表達(dá)載體和前體基因大小及序列均與理論一致。前體蛋白經(jīng)多步純化得到了重組德谷胰島素樣品。質(zhì)譜分析表明其分子量與德谷胰島素理論值一致,均為5826Da。經(jīng)胰島素生物測定法檢測,產(chǎn)物的效價(jià)為26.38IU/mg,有良好的生物學(xué)活性。在搖瓶實(shí)驗(yàn)中,初步比較分析了不同培養(yǎng)基及碳源、氮源、碳氮比和無機(jī)鹽等對重組菌的菌體密度和德谷胰島素前體蛋白表達(dá)量的影響。篩選出最適的培養(yǎng)基配方:葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、硫酸銨1.Og... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１?ＩＮＳ片段膠回收鑒定圖譜??

圖２．２設(shè)計(jì)與檢測序列比對結(jié)果??２Ａ２?

轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌ＢＬ２１宿主細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)過Ｔｅｔ抗性ＬＢ平板篩選，挑取單菌落培養(yǎng)，質(zhì)??粒抽提后用Ｉ和你／?ＩＩ酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)ＤＮＡ瓊脂糖凝膠電泳分析，在約６７０ｂｐ??處可見目的基因條帶，該片段中包括３４５ｂｐ的目的基因。見圖２．３，說明插入結(jié)果正確。??Ｈ漏ｂｐ??ＳＯＯＯｂｐ??２０００ｂ??ｌＯＯＯｂｐ??７５０ｂＰ??：??圖２．３?ＨＳ６３１－ＩＮＳ重組質(zhì)粒酶切鑒定圖譜??Ｍ：?ＤＬ５０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ?（ｂｐ）；?１￣６：?６?個(gè)質(zhì)粒?ＥｃｏＲ?１?和?Ｂｇｌ?丨丨雙酶切結(jié)果??ＦＳｅ．Ｉ５＿ＨＤ２５１?－］２２：．ＸＹ＾Ｉ６ＵＰ．ＵＵ．１２Ｄ？ｊｂｌ?ＲｕｎＳｕ．－？ｄ?Ｆｅ３：Ｓ．?２ＤＩ２．￥ｉ｝ｌ：３０?Ｓ？ｇｍｌ?＼３６?ＴＪ５５ＣＪＣ２??Ｓｕｎｐｉｅ?ＯＳＨ?ｌ２｛Ｑ３＊ｒ＜Ｓ＊Ａ＞Ａ?Ｌｕｅ?�。�?Ｄｕｅ?ｔｐＫｉ〇｜?１５５６?１０３６?ｂｕｎ?ｉｎ?１６３０３?ｋｕｉ?Ｆｉ｜ｔ?Ｉ?ｏｆ?３??￣?ｉｌ?Ｈ?５５?１３￣?￣￣?５?ｉｓ?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3588433