酸性蛋白酶是一種存在于植物、動物、細菌、真菌和病毒等大多數(shù)生物體中的重要蛋白酶,因其以兩個高度保守的天冬氨酸作為催化殘基,因此又稱為天冬氨酸蛋白酶。酸性蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊組成,三級結(jié)構(gòu)呈高度對稱的雙葉構(gòu)型,催化位點位于對稱的裂縫之間,通過激活水分子來裂解肽鍵。酸性蛋白酶在皮革行業(yè)的鞣制,洗滌劑的添加劑,奶酪的制作,飲料和酒類的除濁以及水解廉價底物（如豆渣,蝦殼,菌渣,菇渣,羽毛）等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。本課題從熱帶假絲酵母和近平滑假絲酵母中克隆了52個蛋白酶基因,構(gòu)建了兩種不同重組表達載體——誘導(dǎo)型載體p ICh和組成型載體p IC9BM-GAP,并將含有目的基因的表達載體與畢赤酵母GS115的基因組整合,成功構(gòu)建了47個蛋白酶重組表達菌株。從中篩選得到兩個高產(chǎn)酸性蛋白酶的重組菌株,其中酸性蛋白酶SAPP1的分子量大小為47 k Da,在最適反應(yīng)條件pH 3.0,50℃下測的誘導(dǎo)型最高酶活為405.36 U/m L,組成型為113.98 U/m L,在pH 4.0-6.0和50℃以下酶活較為穩(wěn)定。而酸性蛋白酶SAPT的分子量為50 k Da,最適反應(yīng)條件為pH 3.0,55℃,... 

【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

天冬氨酸酶的催化機理[15]

第二章蛋白酶的克隆及重組表達載體的構(gòu)建23M12圖2-1總RNA電泳圖。M為DL10000DNAMarker；孔道1為近平滑假絲酵母RNA;孔道2為熱帶假絲酵母RNAFigure.2-1TotalRNAelectropherogram.LaneM:DL10000DNAMarker;lane1CandidaparapsilosisRNA;lane2CandidatropicalisRNA2.3.3蛋白酶基因克隆的結(jié)果以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別用不含信號肽的蛋白酶基因設(shè)計的特異性引物進行RT-PCR擴增，其中PCR結(jié)果如圖2-2所示，本研究從近平滑假絲酵母和熱帶假絲酵母的52個蛋白酶基因中成功克隆47個蛋白酶基因，經(jīng)凝膠電泳驗證目的條帶大小與理論的大小一致，并且條帶單一明亮，經(jīng)過回收純化后，可以用于后續(xù)的的實驗。2.3.4陽性克隆驗證在含Amp抗性的平板上分別隨機挑選5個單菌落驗證含不同目的基因的PMD-18T是否成功連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，由于菌落PCR的結(jié)果太多，圖2-3只顯示了部分結(jié)果，凝膠電泳的結(jié)果表明他們?yōu)殛栃钥藬n為了進一步驗證，每個基因從陽性克隆子中挑選兩個送去給生工生物測序，部分測序結(jié)果如附錄Ⅳ，附錄Ⅴ所示，經(jīng)過序列比對，與Genblak報道的相應(yīng)序列高度一致,其中相似度SAPT99.8%，SAPP199.7%。4000bp2000bp28S18S

華南理工大學碩士學位論文24圖2-2RT-PCR產(chǎn)物。M為DL2000DNAMarker；其他孔道為RT-PCR結(jié)果.Figure.2-2ThepartiallyresultsofRT-PCR.LaneM:DL2000DNAMarker;otherlaneswereRT-PCRresults.圖2-3目的基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的部分菌落PCR結(jié)果。M為DL10000DNAmarker；其他孔道為菌落PCR結(jié)果。Figure.2-3TheresultsofcolonyPCRthattargetgenestransformedintoE.coli.LaneM:DL10000DNAMarker;otherlaneswerecolonyPCRresults.

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]霉菌蛋白酶基因的克隆、表達及水解特性的研究[D]. 柯野.華南理工大學 2013
[2]巴氏畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵表達重組人源膠原蛋白[D]. 劉斌.南京理工大學 2012
[3]大豆蛋白的分子修飾及特性研究[D]. 潘思軼.華中農(nóng)業(yè)大學 2005

碩士論文
[1]畢赤酵母高效表達Streptomyces sp.FA1木聚糖酶基因工程菌構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化[D]. 潘陽.江南大學 2018



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