神經(jīng)節(jié)苷脂是具有多種獨(dú)特功能的唾液酸化的鞘糖脂,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健領(lǐng)域。其中,神經(jīng)節(jié)苷脂GM3和GM2等在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá),這與它們具有高度保守的寡糖抗原決定簇相關(guān)。因此合成結(jié)構(gòu)確定、均一的GM3、GM2寡糖對于腫瘤相關(guān)糖疫苗的開發(fā)具有重要意義。本論文通過在大腸桿菌中構(gòu)建多酶表達(dá)體系,實(shí)現(xiàn)了GM3和GM2寡糖鏈的高效合成。并對粗酶液、全細(xì)胞等不同催化體系以及溫度、pH等不同反應(yīng)條件進(jìn)行了探究。主要研究結(jié)果如下:（1）CMP-Neu5Ac合成酶和α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)優(yōu)化。分別將Neisseira meningitides來源的CMP-Neu5Ac合成酶基因SiaB和Pasteurella multocida來源的α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因PmST3克隆到表達(dá)載體pETDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFDuet-1、pACYCDuet-1上,并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3△LacZ,△NanA）。構(gòu)建了E.coli BL21（DE3△LacZ,△NanA,pETDuet-SiaB）等8種SiaB表達(dá)菌株和E.coli BL21（DE3△LacZ,△NanA,... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

一種典型的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)構(gòu)[2,3]

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文2圖1-2神經(jīng)節(jié)苷脂縮寫名稱中各部分含義Fig.1-2Themeaningofeachpartintheabbreviatednameofganglioside1.1.3神經(jīng)節(jié)苷脂的功能研究神經(jīng)節(jié)苷脂具有豐富的生物學(xué)功能[5]。一方面，神經(jīng)節(jié)苷脂參與包括增殖、分化、存活和凋亡等細(xì)胞生理進(jìn)程[6]，其相關(guān)基因缺乏會導(dǎo)致罕見的遺傳疾病，例如溶酶體糖鞘脂貯積病[7]等。另一方面，神經(jīng)節(jié)苷脂在神經(jīng)元可塑性方面扮演著重要角色，具備保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)元的功能。臨床前和臨床研究均表明，GM1可以減輕神經(jīng)毒素引起的神經(jīng)損傷[8]。此外，神經(jīng)節(jié)苷脂還是一種重要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)器,可與多種鈣離子通道作用調(diào)控胞內(nèi)鈣離子平衡[9]�；谏鲜龉δ埽恍┥窠�(jīng)節(jié)苷脂（如研究最為廣泛的GM1神經(jīng)節(jié)苷脂）已被應(yīng)用于治療如阿爾茲海默[10,11]、帕金森綜合癥[12]等神經(jīng)衰退型疾并外傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及神經(jīng)毒素引起的神經(jīng)損傷[13]。此外，臨床試驗表明，在懷孕期間和在配方奶中補(bǔ)充神經(jīng)節(jié)苷脂是改善嬰兒神經(jīng)發(fā)育的安全可行的解決方案[14]。1.1.4神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖的功能研究除直接或間接參與上述生物學(xué)功能外，神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖還具備其他獨(dú)特的作用。首先，許多寡糖結(jié)構(gòu)在外源分子識別過程中扮演著重要角色[15]，是一些病毒、細(xì)菌毒素的特異性結(jié)合配體[16]。例如，霍亂毒素可與細(xì)胞表面的GM1結(jié)合[17]，肉毒桿菌毒素可與GT1b和GQ1b寡糖鏈結(jié)合[18]。因此通過開發(fā)神經(jīng)節(jié)苷脂寡糖類似物阻礙細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂和病原體的結(jié)合，可以有效抑制毒素對細(xì)胞表面的結(jié)合[19]。值得注意的是，細(xì)菌和病毒與神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合能力受唾液酸構(gòu)型影響[20,21]。如，大腸桿菌K99纖維粘附素只與唾液酸形式為Neu5Gc的GM3的結(jié)合，而不與唾液酸形式為Neu5Ac的GM3結(jié)合[22]；對于猿猴病毒40（SV40），其對唾液酸形式為Neu5Gc的

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1-3化學(xué)糖基化反應(yīng)途徑[16]Fig.1-3ChemicalglycosylationreactionpathwaySeeberger小組[30]在2001年報道了一種固相合成寡糖的方法，他們利用寡糖固相合成儀合成了包括一種抗瘧疾毒素寡糖-GPI六糖在內(nèi)的多種寡糖，并將這種寡糖應(yīng)用于糖類疫苗的開發(fā)。相對于液相合成法，利用固相合成法制備具備操作簡單，產(chǎn)物易于分離等優(yōu)勢。然而，這些策略均無法解決糖基化反應(yīng)中的區(qū)域和立體選擇性問題。圖1-4寡糖的固相合成Fig.1-4Solidphasesynthesisofoligosaccharides化學(xué)法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)靈活和且廣泛適用，能實(shí)現(xiàn)寡糖鏈的大規(guī)模合成，但缺點(diǎn)在于反應(yīng)過程過于繁瑣復(fù)雜，純化困難且區(qū)域選擇性和立體選擇性低致使產(chǎn)率不穩(wěn)定等[31]。因此尋找一種區(qū)域和立體選擇性好，無副產(chǎn)物生成的合成寡糖的方法成為一件在寡糖合成方面至關(guān)重要重要的事情。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]神經(jīng)節(jié)苷脂氟化寡糖在大腸桿菌中的生物合成[J]. 劉新平,譚玉萌,張雪,馮雁,楊廣宇.  生物技術(shù)通報. 2019(08)
[2]基于智能手機(jī)比色法定量檢測BCA蛋白濃度[J]. 江珊,戴博.  分析試驗室. 2019(05)
[3]腫瘤糖疫苗的研究進(jìn)展[J]. 霍常鑫,葉新山.  藥學(xué)學(xué)報. 2012(03)



本文編號：3546553