發(fā)布時(shí)間：2021-12-18 11:26

　　L-蘋果酸作為重要的平臺化合物已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。近年來,生物法生產(chǎn)L-蘋果酸已經(jīng)成為了最具前景和高效性的蘋果酸生產(chǎn)方法,包括酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法等。相較與酶轉(zhuǎn)化法,微生物發(fā)酵法具有底物選擇性更多、生產(chǎn)成本更低、產(chǎn)酸效率更高等優(yōu)勢。目前,發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展,但仍然存在食品安全性菌株選擇性少、得率或生產(chǎn)強(qiáng)度較低、廉價(jià)原料利用不充分、雜酸水平較高等問題亟待解決。本研究以絲狀真菌米曲霉作為生產(chǎn)菌株,利用代謝工程手段分別調(diào)控了L-蘋果酸的胞質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、玉米淀粉的底物利用途徑、L-蘋果酸的線粒體合成途徑、雜酸的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等,實(shí)現(xiàn)了蘋果酸的高效合成。主要研究結(jié)果如下:（1）以米曲霉NRRL 3488作為出發(fā)菌株,以葡萄糖為發(fā)酵底物,通過強(qiáng)化L-蘋果酸的胞質(zhì)合成途徑,提高了L-蘋果酸的生產(chǎn)強(qiáng)度。通過過表達(dá)丙酮酸羧化酶PYC和蘋果酸脫氫酶MDH的編碼基因,L-蘋果酸的搖瓶產(chǎn)量由26.1 g/L提高至42.3 g/L。為了平衡rTCA途徑,引入細(xì)菌中草酰乙酸回補(bǔ)途徑,通過共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,L-蘋果酸的產(chǎn)量提高... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

四碳二羧酸結(jié)構(gòu)式Fig.1-1StructureofC4-dicarboxylicacids

江南大學(xué)博士學(xué)位論文6圖1-2 蘋果酸的四條合成途徑(I) 還原TCA途徑；(II) 氧化TCA途徑；(III) 環(huán)型乙醛酸循環(huán)途徑；(IV) 非環(huán)型乙醛酸循環(huán)途徑. YE：最大理論得率（蘋果酸相對葡萄糖的摩爾得率）Fig. 1-2 Four pathways for L-malate production1.2.2.2 蘋果酸胞質(zhì)合成途徑優(yōu)化和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控在傳統(tǒng)的代謝工程手段中，代謝調(diào)控微生物細(xì)胞內(nèi)高附加值產(chǎn)物的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是提高細(xì)胞生產(chǎn)能力最為有效的方法之一[59]。在蘋果酸的代謝途徑中，由于 rTCA 途徑的碳轉(zhuǎn)化率最高，故強(qiáng)化或構(gòu)建 rTCA 途徑一直是代謝工程提高蘋果酸生產(chǎn)的首選策略。除此之外，組合表達(dá)蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、關(guān)鍵酶的定向進(jìn)化、輔酶再生的調(diào)控等也是提高蘋果酸得率的常用方法[45, 47]。酵母菌能夠在高滲透壓和低 pH 的條件下生長良好，因此具有高產(chǎn)有機(jī)酸的天然優(yōu)勢[27]。目前已經(jīng)發(fā)表了一系列關(guān)于 S. cerevisiae 生產(chǎn)蘋果酸的研究報(bào)道。來源于 S.cerevisiae 的 FUM 可同時(shí)定位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體，通過過表達(dá)其編碼基因 fum1，可促進(jìn)富馬酸向蘋果酸的高效轉(zhuǎn)化[43]。在提高蘋果酸生產(chǎn)的方法中

論文總體研究框架


本文編號：3542296