檀香油是來源于植物檀香的一種名貴香料,具有抗菌、美容和鎮(zhèn)靜等作用。α-檀香烯是檀香油主要成分α-檀香醇的前體物質(zhì)。解脂酵母是一種公認(rèn)安全的微生物,可以利用多種碳源生產(chǎn)萜類或生物燃料等多種高附加值產(chǎn)物。本文提出了一種解脂耶氏酵母異源合成α-檀香烯的方法。以解脂耶氏酵母ATCC 201249為底盤菌,將經(jīng)密碼子優(yōu)化的植物源α-檀香烯合成酶STS整合到基因組上,雙相發(fā)酵得到5.19mg/L的α-檀香烯。質(zhì)粒過表達(dá)MVA途徑上游系列基因 ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19、HMG1和fHMG1,發(fā)現(xiàn)ERG8、HMG1和tHMG1可以提高FPP供給并提升產(chǎn)量,其余基因的優(yōu)化更趨向于競爭途徑鯊烯的合成。將關(guān)鍵基因ERG8和HMG1分別進(jìn)行多拷貝優(yōu)化,α-檀香烯的產(chǎn)量均有所提升。又分別構(gòu)建和表達(dá)了單拷貝pERG8HMG1質(zhì)粒和多拷貝ERG8-HMG1模塊,其中單拷貝pERG8HMG1質(zhì)粒過表達(dá)使α-檀香烯產(chǎn)量提升最明顯,達(dá)到13.31mg/L。雙相發(fā)酵優(yōu)化中探索了正十二烷添加量、添加時(shí)間和發(fā)酵時(shí)長對產(chǎn)物積累的影響,在發(fā)酵6h添加10%的正十二烷,發(fā)酵5天最有利于菌體生長和產(chǎn)物積... 

【文章來源】：天津大學(xué)天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２檀香萜類化合物的結(jié)構(gòu)式及合成路徑［７９］??Ｆｉｇ．?１－２?Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ?ｆｏｒｍｕｌａ?ａｎｄ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ｓａｎｄａｌｗｏｏｄ?ｔｅｒｐｅｎｅｓ??（關(guān)鍵酶：ＦＰＰＳ法尼基焦磷酸合成酶，ＳａＳ辦ａ－檀香烯合酶；化合物：１?ｃｔ?－檀香烯，２ａ－ｅｘｏ－??佛手柑油烯，３ｅｐｉ－（３－檀香烯，４Ｐ－檀香烯）??

第３章解脂耶氏酵母產(chǎn)ａ－檀香烯的菌株構(gòu)建??３．２．２外源基因５ＴＳ在解脂酵母基因組的初步表達(dá)??如圖３－２所示是在解脂酵母中初步表達(dá)Ｓｒａ構(gòu)建的表達(dá)模塊??示意圖。我們將表達(dá)模塊以同源雙交換的形??式整合到了解脂酵母ＳＡ菌株的多拷貝位點(diǎn)ｒＺ）況４位點(diǎn)上。??ｒ２?ＴＥＦｌｐ?ＳＴＳ?ＸＰＲ２ｔ?ｒｌ??ｒｌ?ｒｌ??ｒＤＮＡ?ｓｉｔｅ??圖３－２?ｓｒａ表達(dá)模塊整合示意圖??Ｆｉｇ．３－２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＳＴＳ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｍｏｄｕｌｅ?ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ??解脂酵母和釀酒酵母一樣可以通過ＤＮＡ片段的轉(zhuǎn)化、同源重組來將外源基??因自組裝到自身基因組上。需要體內(nèi)同源重組的片段之間需要有８０?ｂｐ左右的同??源區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)使用軟件〇ｌｉｇ〇７設(shè)計(jì)ＤＮＡ片段的擴(kuò)增引物，以解脂耶氏酵母??（Ｆａｍｗｂ?％〇／沖＿〇？?Ｊ７ＵＣ?２Ｗ２辦）的基因組為模板，擴(kuò)增出啟動(dòng)子和??ＸＰｉ？２（終止子，以及ｒＺＷＸ位點(diǎn)的上下同源臂，從基因優(yōu)化公司提供的ｐＵＣ５７??質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出優(yōu)化完成的基因。使用普通ＤＮＡ純化試劑盒對ＰＣＲ產(chǎn)物??進(jìn)行純化回收，條帶不單一時(shí)使用普通瓊脂糖凝膠ＤＮＡ回收試劑盒回收片段。??其中７１設(shè)７；？長４０６５？、義烈２（長４１２匕？、燈５長１６５６匕？，”況４位點(diǎn)的上下同源??臂分別長為７００?ｂｐ和５９９?ｂｐ。回收完成的基因片段，將ｒｌＷＸ上臂和了五廠分、??？Ｓｒａ、三個(gè)基因體外融合成一個(gè)片段，將ｗｒｆｌ３標(biāo)記基因和ｒＺＷＪ下臂融合??成一個(gè)片段并回收

將原始菌和ＳＡ－１接種到搖瓶進(jìn)行雙相發(fā)酵，３天后取正十二烷相檢測ＳＡ－１??工程菌的外排物中是否有目標(biāo)產(chǎn)物ａ－檀香烯的產(chǎn)生，正十二烷相的處理方法參照??２．２．１４。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定結(jié)果如圖３－４所示，和原始菌的發(fā)酵產(chǎn)物相比，??ＳＡ－１的發(fā)酵樣品在１０．８４１處產(chǎn)生一個(gè)新峰，經(jīng)質(zhì)譜圖的與化合物質(zhì)譜圖庫相對??比，發(fā)現(xiàn)該新峰就是目標(biāo)產(chǎn)物ａ－檀香烯，ＣＡＳ號為５１２－６１－８。??ａ?ｊ／?Ｎｅｗ?ｐｅａｋ??ａ－ｈｕｍｌｅｎｅ??Ｊ？——＿＿——????＾＿＾－４??????ｉ?９．６?９７?９?６?９９?１０?１０．１?１０２?１０．３?１０?４?１０?５?１０．６?１０?７?１０．８?１０?９?１１?１１．１?１１２?１１．３?１１?４?１１．５?１１．６?１１?７?１１．８?１１９?１２?１２．１?１２２?１２．３?１２?４?１２Ｓ??４６??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]酵母胞外槐糖脂產(chǎn)生條件優(yōu)化及其抑菌作用[J]. 陳靜,宋欣,曲音波,劉愛芹.  山東大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版). 2005(03)

博士論文
[1]代謝工程改造耶羅維解脂酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素研究[D]. 尹升明.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院 2017



本文編號：3540323