腈水合酶（NHase,EC 4.2.1.84）是一種存在于原核和真核生物中的金屬酶,能夠催化腈類生成相應(yīng)的酰胺類產(chǎn)物,而酰胺類產(chǎn)物作為重要的化工原料和有機(jī)合成中間體,在大宗化學(xué)品生產(chǎn)及醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑,腈水合酶轉(zhuǎn)化腈類體現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì),反應(yīng)條件溫和且反應(yīng)過程中無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生。盡管如此,現(xiàn)階段已報(bào)導(dǎo)的NHase大多底物譜較窄,選擇性較差,難以定向高效地合成目標(biāo)產(chǎn)物;此外,腈水合酶所催化的腈類水合反應(yīng)為放熱反應(yīng),而該酶熱穩(wěn)定性往往較差,以上這些因素限制了腈水合酶在更廣范圍內(nèi)的應(yīng)用。本文通過半理性設(shè)計(jì),基于生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)工程,改變了腈水合酶對(duì)于多氰基腈類底物以及外消旋腈類底物的區(qū)域選擇性和對(duì)映選擇性,并通過基因融合技術(shù),提高了腈水合酶的熱穩(wěn)定性,主要研究結(jié)果如下:（1）基于序列比對(duì),通過定點(diǎn)突變改變了腈水合酶對(duì)于多氰基腈類底物的區(qū)域選擇性。以惡臭假單胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668來(lái)源的腈水合酶（PpNHase）和睪丸酮叢毛單胞菌Comomonas testosteroni來(lái)源的腈水合酶（CtNHase）為對(duì)象,研究?jī)烧邔?duì)二氰基底... 

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微生物體內(nèi)腈類代謝的主要途徑Fig.1-1Nitrilehydrolysispathwayinmicrobes

1.2.1 腈水合酶的分布腈水合酶（Nitrile hydratase，簡(jiǎn)稱NHase）是一類能夠催化腈類化合物中的氰基通過水合作用生成對(duì)應(yīng)的酰胺類化合物的金屬酶（圖1-2）[12-15]。目前，腈水合酶在自然界中主要存在于細(xì)菌等原核生物體內(nèi)，變形菌、放線菌、藍(lán)藻及厚壁菌等菌屬內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有腈水合酶[16]。攜有腈水合酶的菌種一般是通過以腈類化合物為單一碳氮源的選擇性培養(yǎng)基篩選得到的[17, 18]。然而，傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基篩選方法往往耗時(shí)費(fèi)力，周期較長(zhǎng)[19]。隨著基因挖掘技術(shù)的發(fā)展，一些研究組將GenBank基因庫(kù)中被注釋的潛在腈水合酶基因進(jìn)行了表達(dá)與性質(zhì)測(cè)定，比如Xiaolin Pei等人通過將鐵型腈水合酶中鐵離子結(jié)合位點(diǎn)堿基序列與GenBank基因庫(kù)中所有可能的腈水合酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，篩選得到了一種全新的鐵型腈水合酶基因[20]。腈水合酶先前被認(rèn)為只存在于原核生物中，直到研究人員首次在一種海洋真核生物領(lǐng)鞭毛蟲Monosiga brevicollis中發(fā)現(xiàn)了腈水合酶的存在[21]。據(jù)推測(cè)

第一章 緒論3鈷型腈水合酶活性中心配位的是三價(jià)低自旋的非咕啉鈷（圖1-3）[23-26]。除了這兩種主要的金屬離子，腈水合酶活性中心還被發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合其他的金屬離子，來(lái)源于紅球菌Rhodococcus jostii的腈水合酶活性中心可以結(jié)合銅、鈷及鋅三種不同的金屬[27]。此外，一種地中海海綿Aplysina cavernicola來(lái)源的腈水合酶的活性并不嚴(yán)格依賴鐵或鈷離子的攝入，鎂離子也能在一定程度上激活這一來(lái)源的腈水合酶[28]。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Protein Data Bank（PDB）已報(bào)導(dǎo)的腈水合酶晶體結(jié)構(gòu)，腈水合酶的活性中心成爪狀結(jié)構(gòu)，金屬離子與腈水合酶活性中心三個(gè)半胱氨酸殘基上的硫原子及肽鏈骨架上的兩個(gè)酰胺氮原子配位，爪狀結(jié)構(gòu)正上方由一個(gè)一氧化氮分子（鐵型腈水合酶）（圖1-3a）或一個(gè)水分子（鈷型腈水合酶）（圖1-3b）占據(jù)[29-31]。腈水合酶活性中心結(jié)合的金屬離子不僅能夠幫助促進(jìn)底物的水合，還能起到穩(wěn)定腈水合酶構(gòu)象的作用[32]。鐵型腈水合酶主要存在于紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis中

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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