手性胺是合成許多藥物、天然產(chǎn)物、精細(xì)化學(xué)品及生物活性分子的關(guān)鍵中間體,同時它也是一種高效的手性拆分劑。目前,工業(yè)上主要利用酸堿和過渡金屬催化烯酰胺和烯胺等中間體不對稱還原的方法制備手性胺�；瘜W(xué)法制備手性胺存在能耗大、反應(yīng)步驟多和最終得率較低等諸多不足,因此研究開發(fā)更加綠色高效的手性胺合成工藝顯得尤為重要。胺脫氫酶可利用無機(jī)氨作為氨基供體,催化酮不對稱胺化還原制備手性胺。該反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、原子經(jīng)濟(jì)性高、水是唯一的副產(chǎn)物等優(yōu)點,因此胺脫氫酶是手性胺不對稱合成的理想催化劑,在國際學(xué)術(shù)界和工業(yè)界引起廣泛關(guān)注。目前,已報道的大部分胺脫氫酶是由L-氨基酸脫氫酶進(jìn)化而來,其數(shù)量有限且底物譜窄;此外,酶的熱穩(wěn)定性也是影響其實際應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此,本研究的主要目的是通過基因組數(shù)據(jù)庫挖掘和分子改造手段,創(chuàng)制熱穩(wěn)定性好、催化效率高的苯丙胺脫氫酶,拓展其底物譜,促使其在手性胺合成中得到廣泛應(yīng)用。本文首先通過數(shù)據(jù)庫挖掘法克隆得到4個苯丙氨酸脫氫酶,經(jīng)過蛋白可溶性表達(dá)情況分析、活力及熱穩(wěn)定性表征,最終我們篩選得到一個來自于嗜熱菌Geobacillus kaustophilus的苯丙氨酸脫氫酶GkPheDH... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 手性胺
        1.1.1 手性胺的應(yīng)用
        1.1.2 手性胺的合成
            1.1.2.1 手性胺的化學(xué)合成方法
            1.1.2.2 手性胺的生物合成途徑
    1.2 胺脫氫酶的研究
        1.2.1 胺脫氫酶的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 胺脫氫酶的應(yīng)用研究
    1.3 蛋白質(zhì)工程
        1.3.1 酶的熱穩(wěn)定性改造
        1.3.2 酶的底物特異性改造
        1.3.3 酶的立體選擇性改造
        1.3.4 高通量篩選方法的建立
    1.4 本課題研究的背景,目的及意義
    1.5 本課題的研究思路及內(nèi)容提要
第二章 苯丙氨酸脫氫酶的基因挖掘及熱穩(wěn)定性篩選
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
        2.2.3 菌種和培養(yǎng)基
    2.3 實驗方法
        2.3.1 目的基因擴(kuò)增
        2.3.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒
        2.3.3 重組蛋白表達(dá)
        2.3.4 苯丙氨酸脫氫酶活力測定
        2.3.5 重組蛋白的純化
        2.3.6 苯丙胺酸脫氫酶熱穩(wěn)定性測定
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 苯丙胺酸脫氫酶基因的挖掘
        2.4.2 苯丙氨酸脫氫酶的基因克隆
        2.4.3 苯丙氨酸脫氫酶的表達(dá)
        2.4.4 苯丙氨酸脫氫酶的活力篩選
        2.4.5 苯丙氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性篩選
    2.5 本章小結(jié)
第三章 苯丙胺脫氫酶的創(chuàng)制及其酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗主要試劑
        3.2.2 實驗主要儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 定點突變
        3.3.2 苯丙胺脫氫酶的活力測定
        3.3.3 胺脫氫酶純化
        3.3.4 苯丙胺脫氫酶GkAmDH的酶學(xué)性質(zhì)表征
            3.3.4.1 測定GkAmDH的最適溫度
            3.3.4.2 測定GkAmDH的最適pH
            3.3.4.3 GkAmDH對有機(jī)溶劑的耐受性
            3.3.4.4 測定GkAmDH的表觀動力學(xué)常數(shù)
            3.3.4.5 測定酶的操作穩(wěn)定性
            3.3.4.6 外消旋胺標(biāo)品的制備
            3.3.4.7 GkAmDH的底物譜探索
            3.3.4.8 對甲氧基苯丙胺及N-甲基對氟苯丙胺制備反應(yīng)
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.0 苯丙胺脫氫酶的創(chuàng)制
        3.4.1 苯丙胺脫氫酶的可溶表達(dá)情況
        3.4.2 苯丙胺脫氫酶的催化活力
        3.4.3 溫度對苯丙胺脫氫酶GkAmDH活力的影響
        3.4.4 pH對苯丙胺脫氫酶GkAmDH活力的影響
        3.4.5 有機(jī)溶劑對苯丙胺脫氫酶GkAmDH活力的影響
        3.4.6 苯丙胺脫氫酶GkAmDH的表觀動力學(xué)常數(shù)
        3.4.7 GkAmDH、FDH和GDH的操作穩(wěn)定性
        3.4.8 苯丙胺脫氫酶GkAmDH的底物譜
    3.5 本章小結(jié)
第四章 苯丙胺脫氫酶的分子改造
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 實驗試劑
        4.2.2 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 定點(飽和)突變
        4.3.2 易錯PCR
        4.3.3 同源建模與分子對接
        4.3.4 突變庫的建立
            4.3.4.1 一級板
            4.3.4.2 二級板
        4.3.5 突變庫的篩選
        4.3.6 蛋白純化
        4.3.7 酶活力測定
        4.3.8 動力學(xué)常數(shù)測定
        4.3.9 底物譜測定
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 BbAmDH的同源建模與分子對接
        4.4.2 BbAmDH的定點飽和突變
        4.4.3 BbAmDH的隨機(jī)突變
        4.4.4 BbAmDH的突變位點分析
        4.4.5 GkAmDH的定點飽和突變
        4.4.6 GkAmDH突變體的底物譜
        4.4.7 苯丙胺脫氫酶的底物譜拓展
            4.4.7.1 GkPheDH的定點飽和突變
            4.4.7.2 Lys77X/N276X雙點組合突變
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀碩士期間撰寫的論文和專利
致謝



本文編號：3478265