ε-聚賴氨酸（ε-poly-_L-lysine,ε-PL）是由25-35個(gè)_L-賴氨酸單體通過(guò)α-羧基和ε-氨基脫水縮合而成的同型_L-賴氨酸鏈狀聚合物。由于其具有pH使用范圍寬、熱穩(wěn)定好、抑菌性廣、水溶性強(qiáng)以及安全性能高等優(yōu)點(diǎn),目前主要作為防腐劑應(yīng)用在食品防腐和保鮮領(lǐng)域,已經(jīng)在日本、韓國(guó)、美國(guó)和中國(guó)等國(guó)家廣泛使用。同時(shí),作為一種新型陽(yáng)離子生物聚合物,ε-PL還廣泛應(yīng)用于藥物載體和生物材料研究。因此,選育ε-PL高產(chǎn)菌株及探究其高產(chǎn)機(jī)制,實(shí)現(xiàn)低成本、高效率ε-PL發(fā)酵生產(chǎn),為ε-PL的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支撐至關(guān)重要。論文以S.albulus M-Z18為出發(fā)菌株,首先建立了針對(duì)S.albulus培養(yǎng)和ε-PL檢測(cè)的高通量平臺(tái)技術(shù);然后,建立了多次抗生素抗性引入的核糖體工程育種技術(shù),并結(jié)合基因組重排育種技術(shù),大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力;隨后,借助生理生化分析手段,系統(tǒng)分析了突變株較出發(fā)菌株在生理水平上發(fā)生的變化;同時(shí),借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),系統(tǒng)分析了突變株較出發(fā)菌株在蛋白水平上發(fā)生的變化,在此基礎(chǔ)上通過(guò)代謝工... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

ε-PL合成酶的結(jié)構(gòu)

江南大學(xué)博士學(xué)位論文8圖1-4核糖體工程激活細(xì)胞功能示意圖[36]Fig.1-4Schemeofribosomeengineeringtoactivatecellularfunction1.2.5.3核糖體工程的應(yīng)用鏈霉菌、芽孢桿菌、假單胞菌屬等在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，人們利用核糖體工程技術(shù)的相關(guān)理論，在鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等性狀的改良方面獲得了理想的成果。1996年，Shima等[76]發(fā)現(xiàn)變鉛青鏈霉菌TK24突變體（K88E突變）可以激活放線紫紅素的產(chǎn)生，而野生菌本身是不產(chǎn)放線紫紅素的。1997年，Hesketh和Ochi[77]將此類突變引入天藍(lán)色鏈霉菌A3（2）中，放線紫紅素的產(chǎn)量也提高。后來(lái)，KozoOchi團(tuán)隊(duì)不斷在鏈霉菌屬中引入抗生素雙重突變、三重突變乃至八重突變，使得次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成能力不斷提高[37,38]。其他的研究學(xué)者也利用核糖體工程來(lái)提高氯霉素、紡錘菌素、沙利霉素、諾西肽等抗生素的產(chǎn)量[37,78,79]。此外，向微生物細(xì)胞中引入抗藥性突變，還可提高芽孢桿菌α-淀粉酶及蛋白酶的產(chǎn)量[80]。Hosokawa等[81]發(fā)現(xiàn)惡臭假單孢菌的Str、Gen和Rif突變株對(duì)4-對(duì)羥基苯甲酸、甲苯等有機(jī)溶劑的耐受性提高。2004年，Inaoka等[82]通過(guò)引入Rif抗性的rpoB突變，激活了枯草芽孢桿菌中的沉默基因ntdABC，大大提高了3,3-neotrehalosadiamine（NTD）的產(chǎn)量。野生的枯草芽胞桿菌通常不能或者只能合成少量的NTD。Hosaka等[83]將核糖體工程應(yīng)用到基于大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S12突變體K42T（S12蛋白的第42個(gè)氨基酸Lys被Thr替代）蛋白合成能力是野生型核糖體的1.3-2倍左右，核糖體工程技術(shù)在提高無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的蛋白合成效率方面也是一種非常有效的方法。

江南大學(xué)博士學(xué)位論文10（1）建立了針對(duì)S.albulus培養(yǎng)和ε-PL檢測(cè)的高通量平臺(tái)技術(shù)。利用微孔板培養(yǎng)方法，建立了24/48孔板發(fā)酵產(chǎn)ε-PL體系；并建立了與之相匹配的微量、快速檢測(cè)ε-PL方法。（2）建立了多次抗生素抗性引入的核糖體工程育種技術(shù)，并結(jié)合基因組重排育種技術(shù)、“基因組重排+核糖體工程”的育種策略大幅度提高了S.albulus的ε-PL合成能力。（3）比較出發(fā)菌株和ε-PL高產(chǎn)菌株在發(fā)酵性能、基因突變位點(diǎn)、代謝流分布、ATP合成和關(guān)鍵酶活性等的差異，借助生理生化分析手段，系統(tǒng)分析了突變株較出發(fā)菌株在生理水平上發(fā)生的變化。（4）借助比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析了突變株較出發(fā)菌株在蛋白水平上發(fā)生的變化，并通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵蛋白驗(yàn)證差異蛋白對(duì)ε-PL合成的影響。（5）對(duì)出發(fā)菌株與ε-PL高產(chǎn)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，借助比較基因組學(xué)技術(shù)，深入分析了突變株較出發(fā)菌株在基因組水平上發(fā)生的變化。圖1-5本論文的主要框架Fig.1-5Theoutlineofthisstudy

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[4]微生物核糖體工程研究進(jìn)展[J]. 謝庶潔,肖靜,徐俊.  微生物學(xué)報(bào). 2009(08)
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[7]紫外誘變選育多聚賴氨酸高產(chǎn)菌株的研究[J]. 楊玉紅,于雪驪,劉長(zhǎng)江.  北方園藝. 2007(09)
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博士論文
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[3]小白鏈霉菌同步代謝葡萄糖和甘油合成ε-聚賴氨酸的生理機(jī)制研究[D]. 曾昕.江南大學(xué) 2016
[4]小白鏈霉菌響應(yīng)酸性pH高產(chǎn)ε-聚賴氨酸的生理解析[D]. 任喜東.江南大學(xué) 2015
[5]產(chǎn)酸丙酸桿菌耐酸機(jī)制解析及代謝調(diào)控研究[D]. 管寧子.江南大學(xué) 2015

碩士論文
[1]基于細(xì)菌全基因組技術(shù)對(duì)AMDY2-9-2的氧化硫能力研究[D]. 閔婕.南京大學(xué) 2019
[2]小白鏈霉菌響應(yīng)低pH脅迫生理機(jī)制的初步解析[D]. 王開(kāi)方.江南大學(xué) 2019
[3]核糖體工程選育ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌及發(fā)酵pH調(diào)控策略優(yōu)化[D]. 吳光耀.江南大學(xué) 2016
[4]Genome shuffling技術(shù)選育ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌[D]. 李鳳.江南大學(xué) 2012
[5]ε-聚賴氨酸高產(chǎn)菌株選育與發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化[D]. 陳旭升.江南大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3475236