海藻糖酶（EC3.2.1.28）是一種葡萄糖苷水解酶,可以催化一分子海藻糖水解生成兩分子葡萄糖。在乙醇和谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中,添加海藻糖酶可以提高發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙醇和谷氨酸的產(chǎn)量,降低發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?從而降低生產(chǎn)成本,具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí),海藻糖酶還作為海藻糖不耐受病人的一種潛在治療用酶和食品添加劑,但是目前報(bào)道的海藻糖酶重組表達(dá)水平普遍較低,尚沒(méi)有海藻糖酶高產(chǎn)菌株的報(bào)道。本文以無(wú)孢黑曲霉HL-1為蛋白表達(dá)宿主,從六種絲狀真菌中挖掘九個(gè)不同的海藻糖酶基因,并在黑曲霉中進(jìn)行表達(dá)篩選,得到兩個(gè)高活力海藻糖酶基因,通過(guò)利用CRISPR/Cas9技術(shù)、培養(yǎng)基優(yōu)化、過(guò)表達(dá)AmyR（An04g06910）、Cog（An16g03450）、Sed（An16g03450）以及突變Ire A（An01g06550）的方法,構(gòu)建出兩株高活力海藻糖酶高產(chǎn)菌株,發(fā)酵液經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化后,研究其酶學(xué)性質(zhì)并將應(yīng)用于酵母乙醇發(fā)酵,主要研究?jī)?nèi)容如下:（1）構(gòu)建黑曲霉蛋白表達(dá)通用載體,將啟動(dòng)子Pna II/TPI片段、不同海藻糖酶基因分別與線性化的通用表達(dá)載體連接,構(gòu)建出9個(gè)不同海藻糖酶表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化宿主黑曲霉HL-... 

【文章來(lái)源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：136 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

α-α-海藻糖結(jié)構(gòu)式

導(dǎo)致慢性疾病的能力。在分枝桿菌和棒狀桿菌中，海藻糖還是許多細(xì)胞壁糖脂的結(jié)構(gòu)成分，例如在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，既提供藥物的不滲透性，又提供免除吞噬細(xì)胞殺傷保護(hù)作用的細(xì)胞壁“結(jié)合因子”的主要成分是海藻糖6,6-二甲酸酯[7]。1.2海藻糖酶1.2.1海藻糖酶的分類海藻糖酶(Trehalase)是一種葡萄糖苷水解酶，在酶分類上歸屬于水解酶，分類編號(hào)為EC3.2.1.28，可以特異性催化一分子的海藻糖水解生成兩分子的葡萄糖，廣泛分布于包括細(xì)菌、霉菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物在內(nèi)的生物體中[9]。圖1-2海藻糖酶水解作用Fig1-2Structuralformulaoftrehaloseandprincipleoftrehalasehydrolysis海藻糖酶最早由Bourquelot于1893年在黑曲霉中發(fā)現(xiàn)，1895年Fischer在釀酒酵母里也發(fā)現(xiàn)了海藻糖酶，后來(lái)科研人員在不同的生物里不斷地發(fā)現(xiàn)和鑒定了不同的海藻糖酶[10]。根據(jù)已知的和預(yù)測(cè)的蛋白氨基酸序列，在Carbohydrate-ActiveEnZymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫(kù)中，海藻糖酶被分在糖苷水解酶第15、37、65家族(GH15、GH37、GH6)三個(gè)類

華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文8圖1-3絲狀真菌胞外蛋白表達(dá)和分泌途徑[34]Fig1-3Extracellularproteinexpressionandsecretioninfilamentousfungal隨著研究的深入，以上三個(gè)階段的具體機(jī)制和影響因素逐漸被探索出來(lái)，而這些影響因素正是提高絲狀真菌蛋白表達(dá)水平的改造對(duì)象。轉(zhuǎn)錄即是蛋白的DNA序列在RNA聚合酶的作用下合成互補(bǔ)的mRNA序列，這個(gè)階段的主要影響因素包括啟動(dòng)子的強(qiáng)弱、轉(zhuǎn)錄因子的激活、蛋白基因的拷貝數(shù)、蛋白基因在基因組的位置等。翻譯和加工是以蛋白mRNA序列為模板，在核糖體中翻譯成氨基酸多肽鏈，運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊和初步加工，再運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中進(jìn)一步加工修飾成熟，這一階段是目前提高絲狀真菌蛋白表達(dá)水平的主要改造對(duì)象，其主要影響因素包括宿主的密碼子偏好性、信號(hào)肽識(shí)別、非折疊蛋白壓力響應(yīng)(UnfoldedProteinResponse,UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑(ER-AssociatedproteinDegradation,ERAD)、自體吞噬(Autophagy，AP)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的囊泡運(yùn)輸過(guò)程，其中UPR、ERAD和AP是絲狀真菌蛋白合成過(guò)程質(zhì)量控制的關(guān)鍵步驟。分泌是將高爾基體中加工成熟的蛋白通過(guò)囊泡運(yùn)輸?shù)竭_(dá)細(xì)胞質(zhì)膜，最后分泌到細(xì)胞外，這個(gè)階段的主要影響因素是高爾基體和細(xì)胞質(zhì)膜之間的囊泡運(yùn)輸。1.4.1轉(zhuǎn)錄階段的改造策略1、使用強(qiáng)啟動(dòng)子在黑曲霉(A.niger)中常使用的誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子包括黑曲霉糖化酶啟動(dòng)子PglaA[35,36]、黑曲霉中性淀粉酶啟動(dòng)子PamyA[37]，米曲霉(A.oryzae)中常用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為α-淀粉酶啟動(dòng)子Pamy[38]，這三個(gè)啟動(dòng)子都是糖代謝型啟動(dòng)子，在麥芽糖或者淀粉存在時(shí)，可以誘導(dǎo)蛋白基因的大量轉(zhuǎn)錄。此外，Ishida等[39]從米曲霉中篩選出一個(gè)新的強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PsodM（超氧化物酶啟動(dòng)子），用于表達(dá)葡萄糖淀粉酶。目前為止，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]海藻糖酶在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中的應(yīng)用[J]. 王蘭剛,韓雋,李進(jìn),宋小東,王志平,張明.  發(fā)酵科技通訊. 2019(03)
[2]18S rDNA介導(dǎo)的桔青霉核酸酶P1表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析[J]. 陳筱儀,王斌,潘力.  現(xiàn)代食品科技. 2019(06)
[3]Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655海藻糖酶Tre F的重組表達(dá)及性質(zhì)研究[J]. 于林港,宿玲恰,吳敬.  生物技術(shù)通報(bào). 2017(04)
[4]海藻糖酶在谷氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用[J]. 韓雋,姬慧軍.  廣州化工. 2017(07)
[5]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)及其在動(dòng)物基因組定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用[J]. 周金偉,徐綺嬪,姚婧,余樹(shù)民,曹隨忠.  遺傳. 2015(10)
[6]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 李聰,曹文廣.  生物工程學(xué)報(bào). 2015(11)
[7]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展[J]. 劉志國(guó).  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(10)
[8]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[J]. 方銳,暢飛,孫照霖,李寧,孟慶勇.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2013(08)
[9]黑曲霉作為細(xì)胞工廠:知識(shí)準(zhǔn)備與技術(shù)基礎(chǔ)[J]. 郭艷梅,鄭平,孫際賓.  生物工程學(xué)報(bào). 2010(10)
[10]海藻糖酶的酶學(xué)特性及其作為新農(nóng)藥靶標(biāo)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用[J]. 范柯琴,金利群,鄭裕國(guó).  化學(xué)與生物工程. 2009(04)

碩士論文
[1]南極假絲酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表達(dá)及硅藻土固定化應(yīng)用研究[D]. 張玲敏.華南理工大學(xué) 2019
[2]魯氏酵母胞內(nèi)高海藻糖發(fā)酵調(diào)控及代謝特征研究[D]. 劉翠翠.湖北工業(yè)大學(xué) 2018
[3]黑曲霉基因組中單寧酶基因的挖掘篩選及蛋白表達(dá)研究[D]. 劉鳳玲.華南理工大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3402008