類脂A是脂多糖的重要活性成分,其結構的變化將影響革蘭氏陰性菌細胞外膜性質,從而導致細菌耐藥性和毒力的變化。磷酸乙醇胺轉移酶（EptA）是類脂A的結構修飾酶。磷酸乙醇胺基團的修飾使得類脂A上負電荷減少,從而中和了細菌表面的電負性。這一修飾使得多肽類抗生素與細菌外膜結合能力降低,則機體對革蘭氏陰性菌的自身免疫降低。大腸桿菌為重要的模式菌株,構建大腸桿菌磷酸乙醇胺轉移酶缺失菌株便于研究腦膜炎奈瑟氏菌和阪崎腸桿菌的磷酸乙醇胺轉移酶。通過耐藥性實驗和細胞實驗探索磷酸乙醇胺轉移酶影響的細菌耐藥性機制以及細菌的致病機理。本課題的主要研究結論如下:（1）通過比對Neisseria meningitidis MC58和E.coli BL21（DE3）磷酸乙醇胺轉移酶EptA的同源性,在Neisseria meningitidis MC58中發(fā)現EptA編碼基因NMB_RS08540,并命名為NmeptA.構建E.coli BL21（DE3）ΔeptA突變菌株,E.coli BL21（DE3）ΔeptA/pET28a-NmEptA表達菌株,發(fā)現E.coli BL21（DE3）EptA和... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：55 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

大腸桿菌類脂A的合成途徑及PEA修飾Fig.1-1TheconstitutivepathwayofE.colilipidAbiosynthesisandPEAmodification類脂的修飾

第一章緒論3滅細菌[20,21]。細菌進行類脂A正電基團的修飾，將會增強抵抗陽離子抗菌肽的能力。類脂A上的正電荷修飾也是革蘭氏陰性菌獲得性多肽類抗生素耐藥性的主要原因。革蘭氏陰性菌獲得性多肽類抗生素耐藥性是由特殊環(huán)境下PhoP/PhoQ二元調控系統釋放PmrD，從而激活PmrAB調控系統，使得arn系列操縱子被激活，從而進行類脂A的正電修飾（圖1-2）[15,22,23]。根據文獻已知，弗朗西斯菌中的類脂A上1"和4"位上的磷酸基團分別能夠被LpxE、LpxF磷酸酶選擇性地去除。沙門氏菌中首先發(fā)現氨基阿拉伯糖轉移酶（ArnT），類脂A上1"和4"位的磷酸基團能夠在該酶的作用下加上氨基阿拉伯糖基團[24,25]。在弱酸性或在高鎂離子等環(huán)境中，大腸桿菌以及阪崎腸桿菌中磷酸乙醇胺轉移酶（EptA）表達，磷酸乙醇胺基團在該酶的作用下被特異性地加到在類脂A上1"和4"位上的磷酸上[26]。另外，與類脂A正負電荷修飾相關的酶還有LmtA、LpxT和EptB等[27]。類脂A分子形狀的改變主要是依靠脂肪酸鏈數目和長度來改變。有文獻指出，類脂A分子的形狀可能與TLR4的識別有關。在沙門氏菌中，PagL和PagP分別將C3"位上的羥基脂肪酸鏈和C2"位上C16:0脂肪酸鏈去除[28]。大腸桿菌和阪崎腸桿菌中，類脂A在LpxM的作用下將增C12:0或者C14:0的�；舅徭�。同時，在鼠疫桿菌類脂A中含6條脂肪酸鏈的菌體能夠激活TLR4通路，而含4條脂肪酸鏈的菌體無法激活該通路。這也說明類脂A脂肪酸鏈的數目與其感染能力相關。圖1-2革蘭氏陰性菌獲得性多肽類抗生素耐藥性機制[23]Fig.1-2ThemechanismofGram-negativebacteriaacquiredpeptideantibioticresistance.1.2磷酸乙醇胺轉移酶磷酸乙醇胺轉移酶（EptA）是類脂A的正電修飾酶。EptA修飾類脂A上1"或者4"的磷酸基團，使得類脂A的負電荷減少，從而使得細?

?eptA基因進行同源性比對，結果得出NMB_RS08540與eptA的同源性在38.54%，且該基因是由1638bp核苷酸組成編碼的氨基酸序列。NMB_RS10465與eptA的同源性在37.66%，由1578bp核苷酸組成編碼的氨基酸。找到各自下游的兩個基因，分別與E.coli中pmrA和pmrB基因進行比對，見圖3-1。NMB_RS08540下游基因為NMB_RS08535和NMB_RS08530，與pmrA和pmrB同源性為37.26%和25.64%。而NMB_RS10465僅有下游基因NMB_RS10470，該基因與pmrA同源性為8.91%。從兩個基因與E.coli中eptA基因DNA同源性和蛋白同源性來看，NMB_RS08540為eptA的同源基因。圖3-1E.coli和NeisseriameningitidisMC58中磷酸乙醇胺修飾相關基因位置的比較Fig.3-1ThepositionofpEtNphosphotransferasesrelativegenesinE.coliandNeisseriameningitidisMC583.1.2E.coliBL21(DE3)ΔeptA構建和磷酸乙醇胺轉移酶表達為驗證NMB_RS08540基因功能，本研究對E.coliBL21(DE3)的eptA基因進行敲除，并將eptA進行回補表達，CseptA以及NMB_RS08540進行異源表達表達等改造，通過質譜進一步確定其功能。利用Jiang等的基因敲除方法[49]，在E.coliBL21(DE3)的染色體上進行eptA基因的

【參考文獻】：
期刊論文
[1]細菌類脂A的結構修飾及其應用前景[J]. 陳久洲,李燁,王小元.  微生物學通報. 2010(11)
[2]細菌類脂A結構與功能研究進展[J]. 李顏顏,史鋒,李燁,王小元.  微生物學報. 2008(06)

碩士論文
[1]阪崎克羅諾腸桿菌類脂A磷酸乙醇胺轉移酶相關基因的鑒定[D]. 劉璐.江南大學 2017
[2]合成不同結構類脂A分子的大腸桿菌的構建[D]. 韓雅寧.江南大學 2013
[3]大腸桿菌中類脂A分子結構的定向改造[D]. 陳久洲.江南大學 2010



本文編號：3389516