研究目的:本課題將一種特異性結(jié)合DEK蛋白的適配體DTA進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其體內(nèi)穩(wěn)定性,并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考察修飾型靶向DEK適配體對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果,以篩選出最佳新型靶向DEK適配體。研究方法:RNAStructure5.7軟件模擬DTA最佳二級(jí)結(jié)構(gòu),并根據(jù)其二級(jí)結(jié)構(gòu)特征擬在其脫氧核糖的2’位修飾甲氧基、3’端修飾反式脫氧胸苷和5’端修飾膽固醇。變性尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳考察修飾的靶向DEK適配體在DNase I、含2%BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基及90%小鼠血清中的穩(wěn)定性;生物膜干涉技術(shù)研究靶向DEK適配體與DEK蛋白間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。CCK-8法檢測(cè)靶向DEK適配體對(duì)單核巨噬細(xì)胞RAW264.7活性的影響;Percoll不連續(xù)密度梯度離心法從小鼠體內(nèi)提取中性粒細(xì)胞;用LPS或PMA活化提取的中性粒細(xì)胞,并通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和測(cè)定細(xì)胞外dsDNA含量考察靶向DEK適配體對(duì)中性粒細(xì)胞外陷阱（NETs）形成的影響;LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型,通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞刺激后DEK蛋白表達(dá)量變化,并用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α... 

【文章來(lái)源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２?ＤＥＫ適配體的修飾方法及作用機(jī)制圖??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｍｅｔｈｏｄ?ａｎｄ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＤＥＫ?ａｐｔａｍｅｒｓ??

?第二章適配體的表征???Ｗ?＿?１?２?２?４?；?６?７?Ｓ?＆?１０?１１?１２??Ａ｜？Ｇ？?〇？０？？〇０〇０??Ｂ?０？０〇＠〇？？〇〇〇〇??ｃ?？？？〇？〇？？〇〇〇〇??□？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｅ?？？？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｆ?？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??〇？〇？〇？〇？？〇〇〇〇??Ｈｌ（Ｔ）Ｑ００（ｒ）０（？）０〇〇〇〇??圖２．１?ＢＬＩ動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中樣品的設(shè)置??Ｂ：動(dòng)力學(xué)緩沖液；Ｌ：生物素化適配體；Ｒ：再生溶液；粉色孔：ＤＥＫ重組蛋白溶液??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｓａｍｐｌｅ?ｓｅａｉｐｓ?ｆｏｒ?ＢＬＩ?ｋｉｎｅｔｉｃｓ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ??Ｂ：?ｋｉｎｅｔｉｃ?ｂｕｆｆｅｒ；?Ｌ：?ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ?ａｐｔａｍｅｒｓ；?Ｒ：?ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ；?ｐｉｎｋ?ｗｅｌｌ：?ＤＥＫ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｏｌｕｔｉｏｎ??３實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論??３．１?ＤＴＡ二級(jí)結(jié)構(gòu)??尋找適配體的最佳修飾方法以及預(yù)測(cè)適配體與ＤＥＫ蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，首要??步驟之一是預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ軟件能根據(jù)堿基配對(duì)概率預(yù)測(cè)ＲＮＡ??和ＤＮＡ的二級(jí)結(jié)構(gòu)【８１］。該軟件通過(guò)最小自由能原理，當(dāng)達(dá)到最小自由能時(shí)，核??酸分子調(diào)整結(jié)構(gòu)到達(dá)最為穩(wěn)定的狀態(tài)，此時(shí)核酸分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)最接近真實(shí)的??結(jié)構(gòu)。根據(jù)該方法，可以獲得ＤＴＡ最優(yōu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖２．２），并根據(jù)其二級(jí)結(jié)??構(gòu)制定修飾方案（表２．１?）。??１４??

?第二章適配體的表征???５－?Ｇ?Ｔ?■－?Ｔ、Ａ??Ｇ?—?Ｇ?＿?Ｇ??Ａ??ｃ?—?ｃ?ｃ??ｉ?＼?，Ｔ??ａ?廠Ａ?１０??Ｃ??２０??Ａ?，ｃ、＇??ＴＴＧ?Ｃ?—￣?Ｔ?Ｇ?＂?＼??！丨丨?！?Ｉ?Ｉ?Ｇ??Ａ?Ａ?Ｃ、?Ａ?Ｃ?ｃ??Ａ?Ｔ??Ａ??３０??Ｔ??４０?Ａ??３，?Ｇ??ｔｆＳ?？?－Ｊ?ｉｆ?ｎｓ??圖２．２?ＤＴＡ的二級(jí)結(jié)構(gòu)??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｔｌｉｅ?ｓｅｃｏｎｄａｒｙ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＤＴＡ??３．２適配體對(duì)ＤＮａｓｅ?Ｉ的穩(wěn)定性??脫氧核糖核酸酶Ｉ?（ＤＮａｓｅ?Ｉ），是核酸內(nèi)切酶的一種，分子量約為３２?ＫＤａ，??可以將單鏈或雙鏈ＤＮＡ隨機(jī)分解成單個(gè)脫氧核苷酸或寡聚脫氧核苷酸，其活性??依賴(lài)于鈣離子并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活［８２］。在鎂離子存在時(shí)，ＤＮａｓｅ丨能??在ＤＮＡ任意位點(diǎn)上隨機(jī)地產(chǎn)生切口。Ｐｉｅｒｒｅ?Ｊ等人測(cè)定小鼠血清中的鎂離子濃??度為２．８±０．１ｍｇ／ｄＬ［８３］，因此，在本實(shí)驗(yàn)中，采用此濃度的鎂離子來(lái)更好的模擬??適配體在體內(nèi)的酶解過(guò)程。??變性尿素聚丙烯酰胺凝膠在核苷酸堿基配對(duì)抑制劑（尿素或甲酰胺）存在時(shí)??聚合而成，在溫度為４５－５５°Ｃ的條件下，其可以用于非結(jié)構(gòu)化分離和純化單鏈??ＤＮＡ?（ＲＮＡ）片段ｔ８４Ｌ在變性凝膠運(yùn)行過(guò)程中，遷移率與核酸的分子量有關(guān)，??而與空間結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)１８５］，因此可用于核酸適配體的檢測(cè)。適配體在ＤＮａｓｅｌ存在條??件下的電泳圖如圖２．３所示，共孵育后完整適配體所占比例結(jié)果見(jiàn)表２．３。??１５??

【參考文獻(xiàn)】：
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