S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）是生物體內一種重要的中間代謝物,可作為藥物和保健品,具有廣闊的應用前景。本課題組在前期工作中構建了一系列合成SAM的重組畢赤酵母（Pichia pastoris）:DS16（過表達高活性重組SAM合成酶）,G12（弱化DS16中的β-胱硫醚合成酶基因cys4）,G/Dspe（敲除DS16中的S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因spe2）,DS16/DsvA和DS16/DsvP（敲除DS16中的spe2且敲入透明顫菌血紅蛋白基因vgb,前者用PAOX調控vgb,后者為PsADH2）。為進一步促進SAM合成,我們以這些重組菌生理特性分析為基礎,開展代謝工程研究。在正常搖瓶培養(yǎng)條件下,DS16/DsvA和DS16/DsvP的最大比生長速率和存活率均高于G/Dspe,且SAM體積產量分別提高了 14.3%和4.6%。在低氧搖瓶培養(yǎng)時,DS16/DsvA和DS16/DsvP仍可維持較高存活率,SAM體積產量比G/Dspe提高19.1%和9.6%。在5L罐中控制發(fā)酵過程溶氧為10～15%,誘導30 h后DS16/DsvA和DS16/D... 

【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１?ＳＡＭ的分子結構??Ｆｉ．１．１?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＳＡＭ??

?－？￣ＤＳ１６?－ａ－ＤＳ１６／ＤｓｖＡ?．２?－＾－ＤＳ１６?－ａ—ＤＳ１６／ＤｓｖＡ??２０?＾?Ｇ／Ｄｓｐｅ?▼—ＤＳ１６／ＤｓｖＰ?＞?６０?－?—Ｇ／Ｄｓｐｅ?—ＤＳ１６／ＤｓｖＰ??１０——■——１——■——１——？——１——■——１——■——?５０——■——１——■——１——■——１——■——１——１——??０?２０?４０?６０?８０?１００?０?２０?４０?６０?８０?１００??Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?Ｔｉｍｅ?（ｈ）?Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?Ｔｉｍｅ（ｈ）??圖３．１重組菌正常條件下的生長（Ａ）和存活率（Ｂ）??Ｆｉｇ．３．１?Ｇｒｏｗｔｈ?ｃｕｒｖｅ（Ａ）?ａｎｄ?ｃｅｌｌ?ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（Ｂ）?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｕｎｄｅｒ?ｏｘｙｇｅｎ?ｎｏｎ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ??ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??導入Ｖｇ／）基因不僅能促進菌體生長，在提髙菌體存活率上也有很明顯的效果，如圖３．１Ｂ??所示，在發(fā)酵后期無論是ＪＺＷ２還是ＪＯＹ調控ｖ砂表達的菌株，其存活率均高于無ｖｇ６??的菌株，ＤＳ１６的存活率為８３％，?Ｇ／Ｄｓｐｅ的存活率為８２％，而ＤＳ１６／ＤｓｖＡ的存活率達到了??９４％，?ＤＳ１６／ＤｓｖＰ為８７％，可見用ＪＯＹ調控更利于重組菌維持教高的存活率。這可能??是因為ｄＯＶ是甲醇誘導的強啟動子，比低氧誘導的ＪＤ／／２強度更高，導致ｖ妙在ＤＳ１６／ＤｓｖＡ??中的表達水平更高。??３．１．２?ＳＡＭ?產量??為了考察導入ｖ＃）基因并且敲除切以基因對畢赤酵母產ＳＡＭ的影響，９６小時測定各??重組菌的ＳＡＭ積累量。結果如圖３．２所示，相比出發(fā)菌ＤＳ１６，三株改造后的菌ＳＡＭ產?

第２６頁?華東理工大學碩士學位論文????２?０??ｍ?１?＾ａ?￣￣Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ?ＳＡＭ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＡＭ?］?＿??Ｉ?ｎｏ：?￡?｜｜??＿＿?ｎ?＿！??ｉ＂：：；?Ｉ?Ｉ?１?１＾１??蘭?〇ｔ￣￣■?■?■?＊－Ｊ〇．〇?＞??ＤＳ１６?Ｇ／Ｄｓｐｅ?ＤＳ１６／ＤｓｖＡ?ＤＳ１６／ＤｓｖＰ??圖３．２正常條件下四株菌的產量??Ｆｉｇ．３．２?ＳＡＭ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｓｔｒａｉｎｓ?ｕｎｄｅｒ?ｏｘｙｇｅｎ?ｎｏｎ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??３．２低氧條件下?lián)u瓶發(fā)酵??３．２．１菌體生長與存活率??將四株菌接種至含有ＹＰＧ液體培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)兩天，然后將此高菌濃的培養(yǎng)液??轉移至２５０?ｍＬ搖瓶，裝液量為１００?ｍＬ，轉速為１３０?ｒｐｍ，以此來限制供氧，并進行誘導??表達和ＳＡＭ合成，考察限氧條件對重組菌特性的影響。如圖３．３Ａ所示，在開始誘導的２??天內，菌濃會持續(xù)上升，此后隨著氧限制加劇，菌體生長受抑制，隨著不斷補加甲醇和甲??硫氨酸，菌濃有所下降，但插入基因的重組菌仍比另兩株菌高。在存活率方面，四株??菌的情況與正常培養(yǎng)條件下相似，依然是ＤＳ１６／ＤｓｖＡ最高為９２％，Ｇ／Ｄｓｐｅ最低為７５％。??Ａ７０［?－＊－ＤＳ１６?＾－ＤＳ１６／Ｄｓｖａ［?Ｂｌ〇〇ｆ＾＝４＝＝＾４?Ｔ—＾１￣Ｔ?Ｔ??—Ｇ／Ｄｓｐｅ」ｖ—ＤＳ１６／ＤｓｖＰ?Ｖ?—２?＾Ｔ？４—▲一＿１??Ｑ?ｓ〇?＾?＾?６Ｑ?．?－＾－Ｇ／Ｄｓｐｅ－＾ＤＳ＾／ＤｓｖＰ??４５?Ｉ?．?ｉ?

【參考文獻】：
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本文編號：3351326