油酸是一種可再生的生物質(zhì)資源,通過油酸水合酶（PaOH）的催化可以轉(zhuǎn)化為10-羥基硬脂酸;后者在醇脫氫酶（ADH）作用下可轉(zhuǎn)化為10-羰基硬脂酸,再通過進(jìn)一步酶法轉(zhuǎn)化,可以生產(chǎn)中等鏈長（C8-C10）的脂肪醇、脂肪酸、羥基脂肪酸、氨基脂肪酸及二元酸。因此,10-羥基硬脂酸和10-羰基硬脂酸成為油酸生物煉制過程的關(guān)鍵中間體,同時也是高價值的精細(xì)化學(xué)品。ADH催化的氧化反應(yīng)需要輔酶NAD+的參與,在反應(yīng)過程中需要對NAD+進(jìn)行循環(huán)再生以降低反應(yīng)成本。本論文對油酸水合酶PaOH進(jìn)行分子改造,提高了其催化活性及熱穩(wěn)定性;選擇NADH氧化酶催化NAD+再生,并通過耦聯(lián)過氧化氫酶,原位分解雙氧水提供氧氣作為NAD+再生的輔底物,降低了 10-羰基硬脂酸的生產(chǎn)成本。（1）建立油酸水合酶高通量篩選方法。利用M luteus WIUJH20來源的MlADH,催化10-羥基硬脂酸脫氫反應(yīng)將NAD+還原為NADH,加入過量的吩嗪乙基硫酸鹽（PES）和噻唑藍(lán)（MTT）與NADH反應(yīng),可定量地生成一種藍(lán)紫色產(chǎn)物,該物質(zhì)在580 nm處具有可見光吸收峰,可使用分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測。此方法對10-羥基硬脂酸的檢測... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．２?Ａ４４〇隨底物濃度變化散點(diǎn)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．２?Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ?ｏｆ?Ａ４４０?ｖａｒｉｅｓ?ｗｉｔｈ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??

第２〇頁?華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文??０．７?－Ｉ???０．６?＊?＊??０．５?－??ｆ?０．４?－??２??〇?０．３?－?＃??豸?０．２?：?？?？??０．１?－?？??０?＊?ｌ，?ｔ?＊??ｉ?＾??（??１?ｔ??????０?０．２?０．４?０．６?０．８?１??ＰｆｌＯＨ?（Ｕ?ｍＬＪ）??圖２．３?ＡＡ３４Ｄ隨油酸水合酶ＰｆｌＯＨ上載量變化散點(diǎn)圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ?ｏｆ?ＡＡ３４０?ｖａｒｉｅｓ?ｗｉｔｈ?ＰａＯＨ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．??２．４．２．３?ＮＡＤＨ化學(xué)轉(zhuǎn)化終點(diǎn)顯色法??ＭＡＤＨ催化１０－羥基硬脂酸轉(zhuǎn)化為１０－羰基硬脂酸，ＮＡＤ＋被還原為ＮＡＤＨ。在后??續(xù)化學(xué)耦聯(lián)反應(yīng)中，還原態(tài)的ＰＥＳ將從ＮＡＤＨ中得到的電子提供給氧化態(tài)的ＭＴＴ，同??時再生ＮＡＤＨ，如此不斷循環(huán)直至１０－羥基硬脂酸耗盡，生成等摩爾量的還原態(tài)ＭＴＴ，??后者呈藍(lán)紫色，可通過肉眼大致分辨或使用分光光度法在５８０?ｎｍ處進(jìn)行檢測，以此間??接計(jì)算１０－羥基硬脂酸的濃度。??顯色反應(yīng)在９６孔酶標(biāo)板中進(jìn)行，每孔反應(yīng)體系的總體積為２００?ｐＬ，包括：６０?（ａＬ??磷酸鉀緩沖液（１００?ｍＭ，?ｐＨ?７．５）、２０?ｐＬ油酸（２?ｍＭ）、２０此不同濃度（１－１６?ｍＭ）的１０－羥??基硬脂酸、０．１％?〇／ｖ）吐溫－８０。其中油酸和１０－羥基硬脂酸預(yù)先與吐溫－８０混合，超聲至??完全乳化為止。然后加入?１００?吐的?ＮＡＤ＋（２ｍＭ）、ＭＡＤＨｐＯＯＵ．ｍＬ－１）、ＰＥＳ（ｌｍＭ）、??ＭＴＴ（２ｍＭ）的混合液，將９６孔酶標(biāo)板放置于

?第２１頁??４?－Ｉ???ｒ?１．４??＇?＇１２?Ｍ??？?－?ｒｓｍ??＾?．．？＊?＿?１?ｍ?，??？?．▲?－??＝?－?０．８?趦運(yùn)??＾?２?－?？ｙ，??？?．，？．？？．．＊?：?〇．６?１?當(dāng)??！?．?Ｘ＊?■?〇．４?釋??�。颍�?＂?０．２?＾??￡?＇??０?Ｈ???＊＊１?＇?１?？?？????，??０??０?０．５?１?１．５?２??１０－羥苺硬脂酸（ｍＭ）??圖２．４?Ａ５８Ｄ隨底物濃度變化趨勢圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｔｒｅｎｄ?ｃｈａｒｔ?ｏｆ?Ａｓｓｏ?ｗｉｔｈ?ｓｕｂｓｔｒａｔｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．??（？）?Ａ５８０；?（Ａ）?１０－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅａｒｉｃ?ａｃｉｄ?／?Ｐａｌｍｉｔｉｃ?ａｃｉｄ．??在進(jìn)行定點(diǎn)飽和庫及第一輪易錯篩選時，隨機(jī)挑選了?１０個突變體進(jìn)行純化，并使??用氣相色譜分析法對純化的突變體酶進(jìn)行活力分析，結(jié)果圖２．５所示，發(fā)現(xiàn)Ａ５８Ｑ的吸光??值與突變體的純酶比活力呈一定的正比關(guān)系，因此該高通量篩選方法可較為可靠地篩選??出有益突變體。??２１???１．５．??Ａ?？？？％??＇?．．？？？?ｙ?＝?０．４３０７Ｘ?＋?０．５２１??Ｒ２?＝?０．９７９８??０．５?■?＞?Ｉ?？?Ｉ?＂?Ｉ?１??０?１２?３?４??突變體的比活力（Ｕ?ｍｇ＿１?）??圖２．５突變體Ａ５Ｍ與突變體比活力變化趨勢圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｔｒｅｎｄ?ｃｈａｒｔ?ｏｆ?Ａｓｓｏ?ｃｈａｎｇｅ?ｗｉｔｈ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ａｃ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]天然膠乳中蛋白質(zhì)和磷脂對橡膠分子結(jié)構(gòu)的影響[J]. 吳龍梅,王勃翔,曲鵬,周榮杰,廖雙泉.  高分子通報. 2015(06)
[2]油酸及其衍生物的應(yīng)用[J]. 劉剛,努爾買買提·阿不都克里木,吾滿江·艾力,劉遠(yuǎn)鳳,陶敏芳.  新疆師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2004(01)

碩士論文
[1]油酸水合酶與脫氫酶級聯(lián)催化制備10-羰基硬脂酸[D]. 吳艷霞.華東理工大學(xué) 2019



本文編號：3346490