高谷氨酸（α-氨基己二酸）,是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥化工等領(lǐng)域中,但目前主要依靠化學(xué)合成法生產(chǎn),存在著成本高、收率低、污染嚴(yán)重的問題,因此采用經(jīng)濟(jì)、綠色友好的生物合成法來生產(chǎn)α-氨基己二酸具有研究價值。本論文設(shè)計了兩條α-氨基己二酸的生物合成途徑,通過體外酶活測試完成外源酶的篩選,將其導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵,成功檢測到目標(biāo)產(chǎn)物,實現(xiàn)生物合成α-氨基己二酸,最后利用代謝工程改造大腸桿菌逐步提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。具體研究如下:1、兩條合成路徑均是分兩步生成目標(biāo)產(chǎn)物,第一步以賴氨酸為底物生成α-氨基己二酸-δ-半醛（AASA）,第二步用α-氨基己二酸-δ-半醛脫氫酶（AASADH）催化AASA生成α-氨基己二酸。首先測定酵母氨酸途徑中第一步所用釀酒酵母（Sc）和阿維菌素鏈霉菌（Sa）來源的賴氨酸酮戊二酸還原酶（LKR）和酵母氨酸脫氫酶（SDH）的體外活性,發(fā)現(xiàn)只有釀酒酵母來源的ScLKR和ScSDH有體外活性。測定轉(zhuǎn)氨酶途徑中第一步所用紅城紅球菌（Re）和黃桿菌屬（F1）來源的賴氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（LAT）,發(fā)現(xiàn)均有活性且黃桿菌屬來源的FlLAT活性較高轉(zhuǎn)化速率可達(dá)17.47±0.3... 

【文章來源】：北京化工大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－２質(zhì)粒ｐＱＬ０２雙酶切驗證

?｜?ｔ??？?．．?．疆：廣＂??Ｈｒ?１?認(rèn)??－—一?加售＿ｊ＿＾?——ｎ??ＳＪ＾ＪＥ?＿?—…??ＪＵＴ?＿?＿＿?；；??Ｓａｌ．ＫＲ?ＳａＳＤＨ??Ｂ?惟?Ｍａｒｋｅｒ??ＨｈｔｅＦｈ＾?＼＼＼＞ｎ＾ｍ?Ｍａｒｋｅｒ??．?．＇．ｗ．（�。埃桑龋埃耄模幔�??ｋＯａ??：…?…．．—ｍ＼??Ｈ??＾：ｆｒ，???？？？—＊．？?奶??：－．．；Ｊａｌｍｆｃ：?？?ｍ??ｒｕｔ??二每、?４＜??．魏令．??圖２４?（Ａ）?ＳａＬＦＣＲ和ＳａＳＤＨ蛋白粗酶液的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ驗證圖；（Ｂ）?ＳａＬＫＲ和ＳａＳＤＨ蛋白純??化后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ驗證圖。??Ｆｉｇ．２－４?（Ａ）?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳａＬＫＲ?ａｎｄ?ＳａＳＤＨ?ｃｒｕｄｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｂｙ?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；?（Ｂ）?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ??ＳａＬＫＲ?ａｎｄ?ＳａＳＤＨ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｂｙ?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．??Ｓｃ！?ＫＲ?ＳｃＬＫＲ?ＳｃｌＩＣＫ?Ｓｃｆ?ＫＲ?ＳｃＳＤＩ?丨?ＳｅＳＤＨ?Ｓｃｌ．ｋＲ?ＳｃＳＤＨ??Ｍ？ｋａ?ｊａ＾?■?；／．?ｉｍ?ｍｔ?ｍ?丨．＿沾—＾?；Ｖｔ；＾?紳化??Ｂｌｕｅ?Ｐｌｕｓ＇?ＩＶ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ｍａｒｋｅｒ??ｇ戀霸ｆ?轉(zhuǎn)靈：％?ｕ，：??＾．ｔｏ，．：．．．．．?．．．．營??－■．．?．?．?■■．?＾?，？：：，：■；■：：：：＊？?—⑷??；—Ｔ，－?－?＾??，：ｇ＾．；．?，！Ｘ：＾ｊ?＂?＇：：＇＇＾：?：＇：Ｘ：｜｜ｖ?ｆ￣?－?Ｉ?＜??：???｜

第二章酵母氨酸途徑屮酶的篩選及體外酶話分析??０．２６?ｍｇ／ｍＬ、ＳａＳＤＨ?的濃度為?０．２２?ｍｇ／ｍＬ、ＳｃＬＫＲ?的濃度為?０．９０?ｍｇ／ｍＬ、ＳｃＳＤＨ??的濃度為０．４４?ｍｇ／ｍＬ。??ＢＣ?Ａ定量法測定蛋白濃度??０４－?ｙ＝０．７５１？ｒｘ??Ｒ２＝０．９９８６１?ｙ??〇？?０３－??ｉ?，??｜〇２－??。。１＾???００?０?２?０．４?０?６??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?（ｍｇ／ｍｉ）??圖２－６蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。??Ｆｉｇ．２－６?Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．??２．４．４ＳａＬＫＲ、ＳｃＬＫＲ動力學(xué)常數(shù)測定??通過不斷改變底物賴氨酸濃度，用非線性回歸的Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ方程進(jìn)行??動力學(xué)測量，得到其動力學(xué)常數(shù)Ｖｍａｘ、／，再通過計算得到和值。??每組實驗設(shè)置三個平行。??＼?Ｓｄ．ｋＲ（ＮＡＩ）Ｈ）??ｇ?ＳｃＬＩＣＲ（＼ＡＤＰＩｈ???０．００４－?＾??ｇ?／?ｇ?０．１Ｗ４－?／??％?〇?／?｜?Ｊ??Ｊ?０．００２－?／??／?／??０．０００＜?ｄ?０．０００？?ｄ??０?２?４?０?５?１０??［Ｓ｜（ｍ＼〇?丨?Ｓｌｍ＇ｌ??圖２－７?ＳｃＬＫＲ酶促反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系曲線。（Ａ＞?ＳｃＬＫＲ（ＮＡＤＨ）：?（Ｂ）?ＳｃＬＫＲ（ＮＡＤＰＨ）。??Ｆｉｇ．２－７?Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ＳｃＬＫＲ?ｅｎｚｙｍａｔｉｃ?ｒｅｌａｔｉｏｎ?ｒａｔｅ?ａｎｄ?ｓｕｂｓｔｒａ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]合成生物學(xué)技術(shù)發(fā)展帶來的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J]. 袁志明.  華中科技大學(xué)學(xué)報(社會科學(xué)版). 2020(01)
[2]高效液相色譜法測定酵母抽提物中谷氨酸的研究[J]. 李素媛,喻璽,劉恒,余佳,余術(shù),黃龍,趙吉媛.  安徽農(nóng)學(xué)通報. 2018(18)
[3]鄰苯二甲醛柱前衍生化-HPLC測定復(fù)方氨基酸注射液中蛋氨酸亞砜的含量[J]. 邵天舒,郭雷,周長明.  中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué). 2018(04)
[4]組學(xué)技術(shù)在氨基酸生產(chǎn)菌株選育中的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J]. 張權(quán)威,林高揚,馬倩.  發(fā)酵科技通訊. 2017(04)
[5]合成生物學(xué)在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 劉立中,白陽,鄭海,傅雄飛,劉陳立.  生物工程學(xué)報. 2017(03)
[6]氨基酸生產(chǎn)菌株的研究熱點及發(fā)展動向[J]. 陳寧,范曉光.  發(fā)酵科技通訊. 2016(01)
[7]氨基酸對頭霉素C生物合成的影響[J]. 李夢茜,張振旺.  大眾科技. 2015(05)
[8]氨基酸的生物活性及其營養(yǎng)調(diào)控功能的研究進(jìn)展[J]. 王洪榮,季昀.  動物營養(yǎng)學(xué)報. 2013(03)
[9]β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢菌素C的生物合成途徑及調(diào)節(jié)[J]. 楊亞利,徐智策,張志艷,張雪梅.  科技信息. 2010(15)
[10]我國氨基酸生產(chǎn)現(xiàn)狀和發(fā)展建議[J]. 蔡詩貴,熊家林.  湖北化工. 2000(06)

博士論文
[1]利用重組大腸桿菌和核糖開關(guān)進(jìn)行L-賴氨酸生產(chǎn)的研究[D]. 王俊明.山東大學(xué) 2015
[2]基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌L-賴氨酸高產(chǎn)菌[D]. 徐建中.江南大學(xué) 2014

碩士論文
[1]生產(chǎn)7-ACA廢液中α-氨基己二酸的提取工藝研究[D]. 于桂花.河北科技大學(xué) 2010
[2]D-α-氨基己二酸與1，2-苯并異噻唑-3-酮的合成工藝研究[D]. 苗彩霞.華東師范大學(xué) 2009



本文編號：3334263