異戊二烯（Isoprene）是一種具有揮發(fā)性和疏水性的萜類烴分子,是萜類化合物的組成骨架,在橡膠、香水和農(nóng)藥制造等領域有著廣泛的工業(yè)應用。目前主要以石油作為原料獲得異戊二烯,但隨著石油資源的日益枯竭及其使用所帶來的污染使得異戊二烯的生產(chǎn)受到限制,亟需一種綠色無污染且可持續(xù)的異戊二烯合成方法。而近年來隨著生物合成技術的不斷崛起,通過微生物合成異戊二烯成為了當前研究的熱點。其中釀酒酵母作為真核類模式菌株,不僅具有清楚的遺傳背景、高糖代謝分解速率和較強的適應工業(yè)工藝條件能力等優(yōu)點,而且具有天然類異戊二烯合成途徑通量高的優(yōu)點,因而是生產(chǎn)異戊二烯類產(chǎn)品的良好宿主。本研究以釀酒酵母作為底盤細胞,通過增加細胞質(zhì)中乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）通量、篩選甲羥戊酸（MVA）途徑關鍵酶等來挖掘增加異戊二烯合成產(chǎn)量的新途徑。具體結果如下:（1）通過敲除乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）通往線粒體支流的基因來增加細胞質(zhì)中乙酰輔酶A的通量。敲除線粒體丙酮酸載體基因（MPC2）、線粒體孔蛋白基因（POR2）和丙酮酸脫氫酶復合體的Elα亞基基因（PDA1）來切斷Acetyl-CoA通往線粒體的支流來挖掘提高釀酒... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

MVA代謝途徑與MEP代謝途徑Figure.1-1MVAmetabolicpathwayandMEPmetabolicpathwayIDI酶是由IDI1基因編碼，是下游MVA途徑上的一個重要的限速酶[44]

第二章材料與方法13有目的基因兩端的同源臂的片段，同源臂的選擇可根據(jù)已經(jīng)報道的對細胞生長沒有影響的序列[58]，該片段上有3個主要元件：同源臂、KanMX篩選標記和loxP位點。將片段導入細胞，片段會利用目的基因兩端的同源臂定位到要敲除的基因處，然后帶有l(wèi)oxP位點的篩選標記會將目的基因替換掉。原理圖2-1：其原理為雙交換同源重組。圖2-1.雙交換同源重組原理圖Figure.2-1.Schematicdiagramofdoubleexchangehomologousrecombination2.2.3.3基因敲除步驟選取MPC2、POR2和PDA1基因同源臂左右各50bp，以pUG6質(zhì)粒[59]為模板，用MPC2-F和MPC2-R擴增KanMX基因，約1700bp。PCR反應體系如下：表2.6MPC2、POR2和PDA1基因的PCR擴增體系Table.2.6ThegeneofMPC2、POR2andPDA1forPCRamplification試劑加入量（μL）上游引物2下游引物2DNA模板1PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase1ddH2O3810×buffer5dNTPMix1PCR反應程序見2.2.1。采用瓊脂糖凝膠電泳膠回收的方式純化PCR產(chǎn)物，純化步驟見2.2.1；同理，用PDA1-F、PDA1-R和POR2-F、POR2-R擴增，獲得相應的KanMX片段，約1700bp。然后用醋酸鋰化學轉(zhuǎn)化方法[60]將PCR擴增出來的3個片段分別轉(zhuǎn)入CEN.PK2-1C中，30℃培養(yǎng)2-4天。然后挑取轉(zhuǎn)化子，以釀酒酵母CEN.PK2-1C基因組作為對照，以MPC2-TEST-F、MPC2-TEST-R；PDA-TEST-F、PDA-TEST-R和POR2-TEST-F、POR2-TEST–R進行菌落PCR驗證。PCR反應程序見2.2.1。根據(jù)搖瓶發(fā)酵結果，繼續(xù)在敲除基因PDA1的基礎上，選取MPC2、POR2基因同源臂左右各50bp，以pUG6質(zhì)粒[59]為模板，用MPC2-F、MPC2-R和POR2-F、POR2-R擴增KanMX基因，約1700bp。PCR擴增程序同上。然后用醋酸鋰化學轉(zhuǎn)化方法[60]將PCR擴增出來的2個片段分別轉(zhuǎn)入基因PDA1的釀酒酵母感受態(tài)細胞中

江南大學碩士學位論文14證（引物見表2.7）。2.2.3.4重組菌基因組中篩選標記KanMX的去除實驗原理：Cre重組酶（CauseRecombinationEnzyme）是一種最早發(fā)現(xiàn)于P1噬菌體且可以對loxP位點靶向識別，并催化其斷裂及重新連接的DNA重組酶。巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒pGAPzα可以編碼Cre重組酶。經(jīng)過人工修飾的KanMX抗性基因在兩側都具有相同方向的loxP位點，而Cre重組酶可以對loxP位點之間進行重組，使loxP位點之間的部分成環(huán)連接并彈出，從而去除了KanMX篩選標記。其重組去除的過程如圖2-2所示。圖2-2.KanMX篩選標記去除原理圖Figure.2-2KanMXscreeningmarkerremovalschematic實驗步驟如圖2-3。圖2-3.KanMX篩選標記去除步驟Figure2-3.TheprocedureofKanMXscreeningmarkerremoval表2.7敲除基因PDA1，MPC2，POR2所需要的引物Table.2.7PrimersofknockoutgenesPDA1,MPC2,POR2引物名稱引物序列（5′–3′）MPC2-FAAAATTGACACACGAATTATATAAACGAAGTTATACAGAAAAAGATTAAAGAAAAGAAAACAGCTGAAGCTTCGTACGCMPC2-RATATATATGCTTACGTACATATCTTTGACAAAGCAAAGTTTCGAGTTGTAAATTCGGCGTGCATAGGCCACTAGTGGAPOR2-FTCTGTTTTATTCTCGAGTGAAGGAATTGCATGAAGAGGAAAGTGTTAGAAATTACCTACGCAGCTGAAGCTTCGTACGC

【參考文獻】：
期刊論文
[1]不同來源異戊烯基焦磷酸異構酶（IDI）和脫氧木酮糖磷酸合成酶（DXS）對重組大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量的影響[J]. 楊帆,蘇卜利,姚青,李華平,朱紅惠.  食品工業(yè)科技. 2018(18)
[2]異戊二烯及其下游產(chǎn)業(yè)應用分析[J]. 羅淇元.  產(chǎn)業(yè)與科技論壇. 2013(06)



本文編號：3296406