產(chǎn)油微生物可以合成大量甘油三酯（占細(xì)胞干重20-80%,w/w）。其中絲狀真菌和微藻可以合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸,這些具有生物活性的脂肪酸是重要的營(yíng)養(yǎng)食品資源。其他產(chǎn)油微生物,如酵母,合成的常見(jiàn)脂肪酸可以轉(zhuǎn)化成生物柴油,是化石能源的重要替代品。產(chǎn)油絲狀真菌卷枝毛霉,因其高產(chǎn)γ-亞麻酸而備受關(guān)注。大量研究從基因組、蛋白組、代謝流分布和關(guān)鍵酶活性方面報(bào)道了卷枝毛霉的脂質(zhì)積累機(jī)制,并證明了定位于細(xì)胞溶膠中的NADP⁺依賴(lài)的蘋(píng)果酸酶和磷酸戊糖途徑是其脂肪酸合成NADPH的主要來(lái)源。但是,目前對(duì)于卷枝毛霉脂質(zhì)分解代謝的研究,尤其是調(diào)控脂質(zhì)分解代謝的脂肪酶,仍是空白。本論文通過(guò)基因注釋和多種生物信息學(xué)工具系統(tǒng)研究了卷枝毛霉高產(chǎn)脂菌株WJ11和低產(chǎn)脂菌株CBS 277.49中脂肪酶的基因特性;結(jié)合轉(zhuǎn)錄分析找出四個(gè)關(guān)鍵脂肪酶基因,通過(guò)基因過(guò)表達(dá)初步研究了它們的功能;通過(guò)定點(diǎn)突變和酶活分析研究了脂肪酶Lip6和Lip10在脂質(zhì)代謝中的雙重角色;還研究了卷枝毛霉在不同葡萄糖-油脂混合培養(yǎng)基中脂質(zhì)積累和脂肪酶活性的情況。本文主要研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:通過(guò)分析卷枝毛霉高產(chǎn)脂菌株WJ11和... 

【文章來(lái)源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：107 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

產(chǎn)油真菌卷枝毛霉CBS277.49（A）和WJ11（B）的脂滴照片

（GenBank accession LGTF00000000），預(yù)測(cè)了 10973 個(gè)基因模型（平均長(zhǎng)度為 1607 bp）通過(guò)與美國(guó)聯(lián)合基因研究所（Joint Genome Institute，JGI）測(cè)序完成的卷枝毛霉 CB277.49（油脂含量占細(xì)胞干重 15%）的全基因組進(jìn)行比對(duì)[40]，初步繪制了卷枝毛霉脂質(zhì)合成的相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)（圖 1-2）。對(duì)于產(chǎn)油真菌卷枝毛霉而言，氮源耗盡后胞內(nèi)腺苷一磷酸脫氨酶（AMPD）活性上升，腺苷一磷酸（AMP）濃度降低，造成活性依賴(lài)于 AM的線(xiàn)粒體內(nèi) NAD+-依賴(lài)型異檸檬酸脫氫酶（NAD+-isocitrate dehydrogenase, NAD+:ICDH活性降低[40]，引起線(xiàn)粒體內(nèi)異檸檬酸積累，大量異檸檬酸轉(zhuǎn)化成檸檬酸，進(jìn)而導(dǎo)致檸檬酸積累。檸檬酸通過(guò)三羧酸（檸檬酸）轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)出線(xiàn)粒體，在細(xì)胞溶膠內(nèi)被 ATP:檸檬酸裂解酶（ATP:citrate lyase，ACL）裂解，產(chǎn)生脂肪酸合成底物-乙酰輔酶 A[41-44]。除了乙酰-CoA，脂肪酸合成還需要大量的 NADPH。乙酰-CoA 與 NADPH 在乙酰輔酶 A 羧化酶和脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）的催化作用下可以合成不同長(zhǎng)度的脂肪酸，直到棕櫚酸（Palmitic acid，PA，16:0）。PA 在脂肪酸延長(zhǎng)酶（ELOVL）的催化作用下進(jìn)一步延長(zhǎng)生成硬脂酸（Stearic acid，SA，18:0），再經(jīng)過(guò)△9 脫飽和酶、△12 脫飽和酶和△6 脫飽和酶，分別形成油酸（Oleic acid，OA，18:1）、亞油酸（Linoleic acidLA，18:2）和 GLA。

多形漢森酵母（Hansenula polymorpha）中異源表達(dá)產(chǎn)油真菌魯氏毛霉（Mucor rCC 基因，使其脂質(zhì)含量提高了 40%。Tai 等人[40, 49]在耶氏解脂酵母中過(guò)表達(dá)，使其脂質(zhì)含量提高了 2 倍。由此可見(jiàn)，增強(qiáng) ACC 的活性也可以促進(jìn)脂肪酸檸檬酸是合成乙酰輔酶 A 的前體，線(xiàn)粒體內(nèi)檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞溶膠中的同時(shí)需從細(xì)胞溶膠中轉(zhuǎn)入線(xiàn)粒體。最近，我們研究中心對(duì)比了低產(chǎn)脂卷枝毛霉 CBS 產(chǎn)脂高山被孢霉（脂質(zhì)含量占細(xì)胞干重的 50%）的基因組，發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉的線(xiàn)一個(gè)高山被孢霉中不存在的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[50]。據(jù)此，我們推測(cè)這個(gè)蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)控卷枝毛霉脂質(zhì)積累。通過(guò)敲除及過(guò)表達(dá)該基因構(gòu)建重組菌株，對(duì)卷枝毛霉蘋(píng)體與脂質(zhì)積累相關(guān)性進(jìn)行了初步研究。過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的重組菌株的總脂提高了 70%，而敲除蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體菌株的總脂肪酸含量降低了 27%，且過(guò)表達(dá)的胞外蘋(píng)果酸含量降低了 64%，而敲除菌株的胞外蘋(píng)果酸含量相應(yīng)提高了 62果表明，卷枝毛霉蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)體能將細(xì)胞溶膠中的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體。因此加線(xiàn)粒體內(nèi)檸檬酸合成前體，以及促進(jìn)檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率的方式，可能會(huì)促進(jìn)脂成（圖 1-3）[51]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]α-亞麻酸和γ-亞麻酸對(duì)高脂血癥人群的降血脂作用[J]. 戴毅,閆慧慧,王楓.  現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2009(23)
[2]產(chǎn)油微生物的研究及其應(yīng)用[J]. 易紹金,鄭義平.  中外能源. 2006(02)
[3]產(chǎn)油微生物油脂生物合成與代謝調(diào)控研究進(jìn)展[J]. 劉波,孫艷,劉永紅,趙宗保.  微生物學(xué)報(bào). 2005(01)

博士論文
[1]卷枝毛霉脂質(zhì)積累機(jī)制的碳代謝流分析及關(guān)鍵基因改造[D]. 趙利娜.江南大學(xué) 2016
[2]產(chǎn)油真菌卷枝毛霉WJ11高產(chǎn)脂質(zhì)的分子機(jī)制[D]. 唐鑫.江南大學(xué) 2016

碩士論文
[1]木糖代謝在卷枝毛霉脂質(zhì)積累中的作用機(jī)制[D]. 儲(chǔ)林芳.江南大學(xué) 2017
[2]過(guò)表達(dá)脫飽和酶對(duì)卷枝毛霉γ-亞麻酸合成的影響[D]. 欒霄.江南大學(xué) 2015



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