發(fā)布時間：2021-07-17 18:33

　　產(chǎn)油微生物可以合成大量甘油三酯（占細胞干重20-80%,w/w）。其中絲狀真菌和微藻可以合成長鏈多不飽和脂肪酸,這些具有生物活性的脂肪酸是重要的營養(yǎng)食品資源。其他產(chǎn)油微生物,如酵母,合成的常見脂肪酸可以轉(zhuǎn)化成生物柴油,是化石能源的重要替代品。產(chǎn)油絲狀真菌卷枝毛霉,因其高產(chǎn)γ-亞麻酸而備受關注。大量研究從基因組、蛋白組、代謝流分布和關鍵酶活性方面報道了卷枝毛霉的脂質(zhì)積累機制,并證明了定位于細胞溶膠中的NADP⁺依賴的蘋果酸酶和磷酸戊糖途徑是其脂肪酸合成NADPH的主要來源。但是,目前對于卷枝毛霉脂質(zhì)分解代謝的研究,尤其是調(diào)控脂質(zhì)分解代謝的脂肪酶,仍是空白。本論文通過基因注釋和多種生物信息學工具系統(tǒng)研究了卷枝毛霉高產(chǎn)脂菌株WJ11和低產(chǎn)脂菌株CBS 277.49中脂肪酶的基因特性;結(jié)合轉(zhuǎn)錄分析找出四個關鍵脂肪酶基因,通過基因過表達初步研究了它們的功能;通過定點突變和酶活分析研究了脂肪酶Lip6和Lip10在脂質(zhì)代謝中的雙重角色;還研究了卷枝毛霉在不同葡萄糖-油脂混合培養(yǎng)基中脂質(zhì)積累和脂肪酶活性的情況。本文主要研究內(nèi)容和實驗結(jié)果如下:通過分析卷枝毛霉高產(chǎn)脂菌株WJ11和... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：107 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

產(chǎn)油真菌卷枝毛霉CBS277.49（A）和WJ11（B）的脂滴照片

（GenBank accession LGTF00000000），預測了 10973 個基因模型（平均長度為 1607 bp）通過與美國聯(lián)合基因研究所（Joint Genome Institute，JGI）測序完成的卷枝毛霉 CB277.49（油脂含量占細胞干重 15%）的全基因組進行比對[40]，初步繪制了卷枝毛霉脂質(zhì)合成的相關代謝網(wǎng)絡（圖 1-2）。對于產(chǎn)油真菌卷枝毛霉而言，氮源耗盡后胞內(nèi)腺苷一磷酸脫氨酶（AMPD）活性上升，腺苷一磷酸（AMP）濃度降低，造成活性依賴于 AM的線粒體內(nèi) NAD+-依賴型異檸檬酸脫氫酶（NAD+-isocitrate dehydrogenase, NAD+:ICDH活性降低[40]，引起線粒體內(nèi)異檸檬酸積累，大量異檸檬酸轉(zhuǎn)化成檸檬酸，進而導致檸檬酸積累。檸檬酸通過三羧酸（檸檬酸）轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)出線粒體，在細胞溶膠內(nèi)被 ATP:檸檬酸裂解酶（ATP:citrate lyase，ACL）裂解，產(chǎn)生脂肪酸合成底物-乙酰輔酶 A[41-44]。除了乙酰-CoA，脂肪酸合成還需要大量的 NADPH。乙酰-CoA 與 NADPH 在乙酰輔酶 A 羧化酶和脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，F(xiàn)AS）的催化作用下可以合成不同長度的脂肪酸，直到棕櫚酸（Palmitic acid，PA，16:0）。PA 在脂肪酸延長酶（ELOVL）的催化作用下進一步延長生成硬脂酸（Stearic acid，SA，18:0），再經(jīng)過△9 脫飽和酶、△12 脫飽和酶和△6 脫飽和酶，分別形成油酸（Oleic acid，OA，18:1）、亞油酸（Linoleic acidLA，18:2）和 GLA。

多形漢森酵母（Hansenula polymorpha）中異源表達產(chǎn)油真菌魯氏毛霉（Mucor rCC 基因，使其脂質(zhì)含量提高了 40%。Tai 等人[40, 49]在耶氏解脂酵母中過表達，使其脂質(zhì)含量提高了 2 倍。由此可見，增強 ACC 的活性也可以促進脂肪酸檸檬酸是合成乙酰輔酶 A 的前體，線粒體內(nèi)檸檬酸轉(zhuǎn)運到細胞溶膠中的同時需從細胞溶膠中轉(zhuǎn)入線粒體。最近，我們研究中心對比了低產(chǎn)脂卷枝毛霉 CBS 產(chǎn)脂高山被孢霉（脂質(zhì)含量占細胞干重的 50%）的基因組，發(fā)現(xiàn)卷枝毛霉的線一個高山被孢霉中不存在的蘋果酸轉(zhuǎn)運體[50]。據(jù)此，我們推測這個蘋果酸轉(zhuǎn)運控卷枝毛霉脂質(zhì)積累。通過敲除及過表達該基因構(gòu)建重組菌株，對卷枝毛霉蘋體與脂質(zhì)積累相關性進行了初步研究。過表達蘋果酸轉(zhuǎn)運體的重組菌株的總脂提高了 70%，而敲除蘋果酸轉(zhuǎn)運體菌株的總脂肪酸含量降低了 27%，且過表達的胞外蘋果酸含量降低了 64%，而敲除菌株的胞外蘋果酸含量相應提高了 62果表明，卷枝毛霉蘋果酸轉(zhuǎn)運體能將細胞溶膠中的蘋果酸轉(zhuǎn)運至線粒體。因此加線粒體內(nèi)檸檬酸合成前體，以及促進檸檬酸轉(zhuǎn)運效率的方式，可能會促進脂成（圖 1-3）[51]。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]α-亞麻酸和γ-亞麻酸對高脂血癥人群的降血脂作用[J]. 戴毅,閆慧慧,王楓.  現(xiàn)代生物醫(yī)學進展. 2009(23)
[2]產(chǎn)油微生物的研究及其應用[J]. 易紹金,鄭義平.  中外能源. 2006(02)
[3]產(chǎn)油微生物油脂生物合成與代謝調(diào)控研究進展[J]. 劉波,孫艷,劉永紅,趙宗保.  微生物學報. 2005(01)

博士論文
[1]卷枝毛霉脂質(zhì)積累機制的碳代謝流分析及關鍵基因改造[D]. 趙利娜.江南大學 2016
[2]產(chǎn)油真菌卷枝毛霉WJ11高產(chǎn)脂質(zhì)的分子機制[D]. 唐鑫.江南大學 2016

碩士論文
[1]木糖代謝在卷枝毛霉脂質(zhì)積累中的作用機制[D]. 儲林芳.江南大學 2017
[2]過表達脫飽和酶對卷枝毛霉γ-亞麻酸合成的影響[D]. 欒霄.江南大學 2015



本文編號：3288709