富馬酸酶（fumarase,EC4.2.1.2）是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶之一,催化富馬酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸這一可逆反應(yīng)。由于具有相對(duì)較好的熱穩(wěn)定性且反應(yīng)不依賴(lài)于鐵離子,其中的富馬酸酶C（FumC）被應(yīng)用于L-蘋(píng)果酸的工業(yè)生產(chǎn)。隨著國(guó)家對(duì)環(huán)保的日益重視和環(huán)保稅的開(kāi)征,企業(yè)在節(jié)能降耗減排方面的需求也與日俱增。進(jìn)一步提高FumC的穩(wěn)定性,不但可以降低固定化酶在工業(yè)使用環(huán)境下的失活速率,延長(zhǎng)其使用壽命,而且有利于降低單位產(chǎn)品的原料和能源消耗,減少污染物排放,具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。本論文在調(diào)研國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,選取了五種不同來(lái)源的FumC基因,在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行克隆表達(dá),基于單位發(fā)酵液體積的酶活與純酶比酶活的測(cè)定和比較,選取了來(lái)源于大腸桿菌的FumC（EEF）和來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌的FumC（EGF）進(jìn)行轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定性的研究。將含這兩種酶的重組菌全細(xì)胞固定化,考察其催化富馬酸產(chǎn)L-蘋(píng)果酸的反應(yīng),結(jié)果表明,兩者對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率都能達(dá)到80%左右,且在持續(xù)22個(gè)反應(yīng)批次間轉(zhuǎn)化率都沒(méi)有明顯下降,均具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。所以,選擇這兩種FumC同時(shí)進(jìn)行熱穩(wěn)定性的改造。首先,以EGF為親本,... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．３?ＩＩ類(lèi)富馬酸酶單體的結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｃｌａｓｓ?ＩＩ?ｆｕｍａｒａｓｅ?ｍｏｎｏｍｅｒ??

ＩＩ類(lèi)富馬酸酶四聚體的每個(gè)亞基都是由Ｄｌ，Ｄ２和Ｄ３這三個(gè)結(jié)構(gòu)域形成的??啞鈐狀的單體結(jié)構(gòu)。Ｄ１始于Ｎ末端，Ｄ３位于多肽鏈的Ｃ末端，中心域Ｄ２由一??個(gè)獨(dú)特的五螺旋束組成。ＩＩ類(lèi)富馬酸酶單體的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖１．３［Ｍ］，圖中的紅??色、綠色和紫色三部分代表了超家族內(nèi)并置的三個(gè)高度保守區(qū)域，分別為區(qū)域一、??區(qū)域二和區(qū)域三。ＩＩ類(lèi)富馬酸酶四聚體的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖１．４［２３】，在四聚體結(jié)構(gòu)??中，四個(gè)Ｄ２結(jié)構(gòu)域的結(jié)合形成了含有２０個(gè)幾乎平行的ａ－螺旋的核心。另外兩個(gè)??結(jié)構(gòu)域Ｄ１和Ｄ３拓展了核心單元的頂部，底部和兩側(cè)，并在四聚體的上下兩端??蓋住了螺旋束。ＩＩ類(lèi)富馬酸酶中的三個(gè)保守區(qū)域在單體結(jié)構(gòu)上是互不相鄰的，圖??中的紅色就表示了在同一個(gè)亞基內(nèi)的三個(gè)保守區(qū)域。但來(lái)自三個(gè)不同亞基的三個(gè)??保守區(qū)域在四聚體中卻是以并列的方式排列在一起，區(qū)域中的氨基酸側(cè)鏈聚合形??成了酶的活性位點(diǎn)，活性位點(diǎn)位于Ｄ１和Ｄ２結(jié)構(gòu)域之間。圖１．４中活性位點(diǎn)的??紫色

浙江大學(xué)碩士論文?玄獻(xiàn)綜詁??圖１．４?ＩＩ類(lèi)富馬酸酶四聚體的結(jié)構(gòu)示意圖??Ｆｉｇ．?１．４?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｃｌａｓｓ?ＩＩ?ｆｕｍａｒａｓｅ?ｔｅｔｒａｍｅｒ??在大腸桿菌ＦｕｍＣ和酵母ｆｕｍａｒａｓｅ的中均發(fā)現(xiàn)了與活性位點(diǎn)上的氨基酸殘??基形成了氫鍵的水分子，說(shuō)明水分子在酶的催化過(guò)程中起到了重要的作用。有些??ＩＩ類(lèi)富馬酸酶還能被底物或其它二羧酸及陰離子在活性位點(diǎn)之外的第二結(jié)合位??點(diǎn)激活。例如大腸桿菌的ＦｕｍＣ不但能因檸檬酸與活性位點(diǎn)（ｓｉｔｅＡ）的結(jié)合而??被激活，也能因Ｌ－蘋(píng)果酸結(jié)合到活性位點(diǎn)附近約１２?Ａ的二羧酸結(jié)合位點(diǎn)（ｓｉｔｅ?Ｂ）??后被激活。由于Ｌ－蘋(píng)果酸在該反應(yīng)中起到了激活劑的作用，因此認(rèn)為該第二結(jié)??合位點(diǎn)是激活因子的激活位點(diǎn)（ａｃｔｉｖａｔｏｒｓｉｔｅ）�；钚晕稽c(diǎn)是由來(lái)自三個(gè)亞基的??三個(gè)保守區(qū)域共同形成的結(jié)構(gòu)，而激活位點(diǎn)是由一個(gè)亞基單獨(dú)形成［３（）］。??１．２．３富馬酸酶熱穩(wěn)定性的研究現(xiàn)狀??由于富馬酸酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)Ｌ－蘋(píng)果酸時(shí)具有工藝簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，??故受到生產(chǎn)Ｌ－蘋(píng)果酸的廠家的重視�？紤]到生產(chǎn)過(guò)程中的操作便捷性和生產(chǎn)的??成本，工業(yè)上基本采用全細(xì)胞來(lái)催化富馬酸生產(chǎn)Ｌ－蘋(píng)果酸。但是在反應(yīng)溫度不??高的條件下，細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶和其他雜酶會(huì)催化富馬酸生成琥珀酸等副產(chǎn)??物

【參考文獻(xiàn)】：
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