Methylobacterium sp.MB200是本實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)研究中分離的一株兼性甲基營(yíng)養(yǎng)菌,具有合成L-絲氨酸的能力。然而,其對(duì)甲醇的低耐受性限制了該菌的進(jìn)一步應(yīng)用,較高濃度的甲醇及其濃度的突然變化通常對(duì)這些細(xì)菌有一定的毒性作用,2.5%（v/v）甲醇可以完全抑制MB200的生長(zhǎng)。甘氨酸是利用甲基營(yíng)養(yǎng)菌進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)L-絲氨酸的重要前體物,在L-絲氨酸生產(chǎn)工程中,添加一定量的甘氨酸可在一定程度上增加L-絲氨酸的產(chǎn)量。本文從甲基營(yíng)養(yǎng)菌生長(zhǎng)所需的底物（甲醇）和L-絲氨酸工業(yè)生產(chǎn)重要的前體物（甘氨酸）耐受的角度出發(fā),通過(guò)相關(guān)基因的研究以期為更好地利用高甲醇或甘氨酸獲得高L-絲氨酸產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)利用自殺質(zhì)粒pK18mob,構(gòu)建質(zhì)粒載體pK18mob-mutlps,三親本接合的手段構(gòu)建甲基營(yíng)養(yǎng)菌M.sp.MB200突變修復(fù)基因mutL的插入突變株MB200m TB。以1.6%甲醇含量作為甲醇誘導(dǎo)的初始濃度,以0.2%為一個(gè)梯度,逐步增加誘導(dǎo)馴化環(huán)境中的甲醇濃度,在不斷地馴化誘導(dǎo)下,平板篩選到10株可以在7%甲醇環(huán)境中生長(zhǎng)的菌株。利用能夠在甲基營(yíng)養(yǎng)菌中進(jìn)行基因表達(dá)的通用廣宿主載體p C... 

【文章來(lái)源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：92 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

M.extorquensAM1的甲基代謝模式

廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文Methylobacteriumsp.MB200突變修復(fù)基因mutL及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因trmf的初步研究37圖3-1PCR擴(kuò)增的DNA片段Figure3-1ThetargetDNAfragmentamplifiedbyPCR3.1.2擴(kuò)增基因的驗(yàn)證將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-Tvector載體上，命名為pMD18T-MutL，轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α，在含有抗生素X-gal、IPTG和Amp的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑進(jìn)行酶切分析鑒定后，送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增所得DNA全長(zhǎng)2195bp，其中MutL基因長(zhǎng)度1838bp，通過(guò)Genbank進(jìn)行序列對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)該片段與Genbank上報(bào)道的AM1的mutL基因序列有91%的相似性。其全序列見附錄二。3.2MutL基因突變株的構(gòu)建質(zhì)粒載體pK18mob是一種自殺質(zhì)粒，質(zhì)粒小，拷貝數(shù)高，便于DNA操作；攜帶有多克隆位點(diǎn)供外源片段克隆；帶有l(wèi)ac基因，有藍(lán)白斑反應(yīng)方便重組子的篩眩構(gòu)建帶有目的基因的pK18mob重組質(zhì)粒，其在進(jìn)入野生菌株MB200后，可與菌株基因組DNA發(fā)生同源單交換，將目標(biāo)基因插入突變，使之失活。3.2.1MutL基因的克隆根據(jù)已擴(kuò)增出的mutL基因序列，使用VectorNTI設(shè)計(jì)引物MutL-P1/MutL-P2，使用TaKaRa公司的TaKaRaLATaq聚合酶，對(duì)mutL基因內(nèi)部片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增出一條1.0kb大小的DNA片段（圖3-2）。

廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文Methylobacteriumsp.MB200突變修復(fù)基因mutL及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因trmf的初步研究38圖3-2PCR擴(kuò)增的DNA片段Figure3-2ThetargetDNAfragmentamplifiedbyPCR3.2.2擴(kuò)增基因的驗(yàn)證將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-Tvector載體上，命名為pMD18T-MutLps，轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliDH5α，在含有抗生素X-gal、IPTG和Amp的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白斑酶切分析鑒定后，送至上海生工進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其全長(zhǎng)1074bp，是mutL基因的片段，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。3.2.3重組質(zhì)粒pK18mob-mutlps的構(gòu)建將mutL片段（mutLps）用PstI與HindIII從載體pMD18T-MutLps上酶切下，純化回收后與同樣用PstI與HindIII酶切的pK18mob載體連接，得到重組質(zhì)粒pK18mob--mutLps，化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。在含抗生素Km、X-Gal和IPTG的LA平板上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)出的菌落，提取質(zhì)粒并限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定（圖3-3）。如圖所示，從培養(yǎng)的DH5α中提取的質(zhì)粒，其在酶切后產(chǎn)生兩條條帶，其中一條為符合載體大小的條帶，另一條符合所插入的DNA大小的條帶，證明重組質(zhì)粒pK18mob-mutlps被成功轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中。

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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本文編號(hào)：3254779