枯草桿菌蛋白酶屬于細(xì)胞外絲氨酸內(nèi)肽酶�？莶輻U菌蛋白酶存在于古細(xì)菌、真細(xì)菌、真核生物和病毒中,主要特征是存在保守的Asp,His和Ser催化三聯(lián)體�？莶輻U菌蛋白酶屬于絲氨酸肽酶或蛋白酶第二大家族（S8家族）的S8A亞家族成員�？莶輻U菌蛋白酶具有廣泛的底物特異性,在中性和堿性pH下具有較高活性和穩(wěn)定性,常被用作洗滌、制革、食品等行業(yè)的生物添加劑�？莶輻U菌蛋白酶在過(guò)去幾十年一直是酶制劑研究開發(fā)的熱點(diǎn)。本論文首先化學(xué)合成嗜堿性芽孢桿菌PB92的堿性蛋白酶基因Bapb92克隆至pBE2R載體中并轉(zhuǎn)化到Bacillus subtilis WB600中構(gòu)建重組工程菌Bacillus subtilis WB600/pBE2R-Bapb92。重組枯草桿菌工程菌利用糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母提取物1%,NaCl 0.5%,pH7.0培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵表達(dá),培養(yǎng)60小時(shí)后進(jìn)行菌液分離。發(fā)酵上清液經(jīng)70%硫酸銨沉淀、SephadexG-25脫鹽和Sephadex75層析三個(gè)步驟,獲得電泳純的堿性蛋白酶,純化倍數(shù)6.8倍,比活2200U/mg,產(chǎn)率39%,經(jīng)12%SDS-PAGE和質(zhì)譜檢測(cè)目的蛋白分子量為26.... 

【文章來(lái)源】：山西大學(xué)山西省

【文章頁(yè)數(shù)】：87 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

MEROPS數(shù)據(jù)庫(kù)中絲氨酸蛋白酶家族中胰蛋白酶家族和枯草桿菌蛋白酶家族中典型的蛋白酶成熟肽結(jié)構(gòu)對(duì)比

第一章綜述7圖1.2生物催化工藝開發(fā)策略[31-33]Figure1.2Biocatalyticprocessdevelopmentstrategies.1.4.1菌種的篩選和改良在用于工業(yè)領(lǐng)域中的微生物中，芽孢桿菌屬是生產(chǎn)堿性蛋白酶的主要來(lái)源。芽孢桿菌屬是細(xì)菌中最古老和最多樣化的屬類[34]，屬于兼性厭氧或需氧的革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀，有內(nèi)生孢子形成，基因組大小介于3.35Mb和5.5Mb之間，GC含量35%-46%，其特征具有多樣性[35]。芽孢桿菌屬的一個(gè)重要的工業(yè)應(yīng)用是酶的生產(chǎn)，包括脂肪酶、碳水化合物活性酶、蛋白酶等，其中蛋白水解酶占有重要的作用[36]。芽孢桿菌具有生長(zhǎng)迅速、發(fā)酵周期短、分泌大量蛋白至胞外培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)上是一種重要的生產(chǎn)菌種，大多數(shù)芽孢桿菌向培養(yǎng)基中分泌的絲氨酸蛋白酶，被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、皮革、制藥、醫(yī)療和洗滌工業(yè)領(lǐng)域[37]。美國(guó)食品和藥品管理局已將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌授予GRAS（公認(rèn)安全）狀態(tài)。盡管基因工程和蛋白質(zhì)工程改變了蛋白質(zhì)的性質(zhì)，但仍不可能獲得完全理想的微生物蛋白酶。生物多樣性是生物技術(shù)創(chuàng)新的寶貴資源，對(duì)于尋找工業(yè)中使用的理想菌種起著關(guān)鍵作用。南北極、鹽堿地或者火山深海這些極端環(huán)境中分離的微生物產(chǎn)生的酶可能具有一些天然適合工業(yè)使用的性質(zhì)。每年大約有十種新的野生型subtilisin出現(xiàn)在專利或文獻(xiàn)中[29,38,39]，除了經(jīng)典的微生物篩選方法外，還通過(guò)全基因組篩選新特征的酶[37]。但菌種改良自始至終在微生物發(fā)酵工藝的商業(yè)開發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通常，野生菌的產(chǎn)酶量是有限的，然而在很多情況下，選擇一些簡(jiǎn)單的方法例如在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，有可能挑選出產(chǎn)量大幅度

第二章枯草桿菌蛋白酶BAPB92重組表達(dá)及純化27pBE2R-F2pBE2R-R2模板2ddH2O1.9dNTP1EasyTaqDNAPolymerase0.1圖2.1pBE2R-Bapb92表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程質(zhì)粒圖譜Figure2.1PlasmidmapofconstructionofexpressionvectorpBE2R-Bapb922.3.2BAPB92的表達(dá)（1）重組質(zhì)粒pBE2R-Bapb92的轉(zhuǎn)化BacillussubtilisWB600感受態(tài)的制備是使用Spizizen創(chuàng)立的方法經(jīng)過(guò)一定改進(jìn)得來(lái)的[7,11-15]：首先將活化后的單菌落接種于GMⅠ中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD=0.6~0.8；在GMII溶液中接種10%的GMⅠ菌液，37℃培養(yǎng)至OD=0.3~0.4；將菌液冰浴30min后低速離心（5000rpm）棄上清，加入10mLGMⅢ分裝后保存在-80℃冰箱中。將測(cè)序正確的質(zhì)粒5μL轉(zhuǎn)入BacillussubtilisWB600感受態(tài)細(xì)胞中，37℃，200rpm培養(yǎng)90min后涂布在含有卡那霉素抗性（40μg/mL）的牛奶平板（蛋白胨1%，NaCl1%，酵母提取物0.5%，牛奶2%，瓊脂粉1.5%，pH7.0[7,11]）上，于37℃培養(yǎng)24h，獲得重組BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92，根據(jù)透明圈初步判斷是否產(chǎn)生蛋白酶[7,16]。（2）BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92蛋白酶的發(fā)酵

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]響應(yīng)面法優(yōu)化短小芽孢桿菌SCU11發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶及關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析[J]. 尹萌萌,賀婷停,王超,宋婷,王海燕.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2016(03)
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碩士論文
[1]產(chǎn)堿性蛋白酶菌株BN-2的鑒定及其重組酶的酶學(xué)性質(zhì)表征[D]. 魏婷婷.山西大學(xué) 2019
[2]畢赤酵母和枯草桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的對(duì)比研究[D]. 王境.山西大學(xué) 2019
[3]提取分離枯草芽孢桿菌中性蛋白酶生產(chǎn)工藝的研究[D]. 趙素珍.齊魯工業(yè)大學(xué) 2017
[4]大腸桿菌—枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體pBE2R的構(gòu)建及應(yīng)用[D]. 梁曉梅.天津科技大學(xué) 2011



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