枯草桿菌蛋白酶屬于細胞外絲氨酸內(nèi)肽酶。枯草桿菌蛋白酶存在于古細菌、真細菌、真核生物和病毒中,主要特征是存在保守的Asp,His和Ser催化三聯(lián)體�？莶輻U菌蛋白酶屬于絲氨酸肽酶或蛋白酶第二大家族（S8家族）的S8A亞家族成員�？莶輻U菌蛋白酶具有廣泛的底物特異性,在中性和堿性pH下具有較高活性和穩(wěn)定性,常被用作洗滌、制革、食品等行業(yè)的生物添加劑�？莶輻U菌蛋白酶在過去幾十年一直是酶制劑研究開發(fā)的熱點。本論文首先化學合成嗜堿性芽孢桿菌PB92的堿性蛋白酶基因Bapb92克隆至pBE2R載體中并轉(zhuǎn)化到Bacillus subtilis WB600中構(gòu)建重組工程菌Bacillus subtilis WB600/pBE2R-Bapb92。重組枯草桿菌工程菌利用糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母提取物1%,NaCl 0.5%,pH7.0培養(yǎng)基進行發(fā)酵表達,培養(yǎng)60小時后進行菌液分離。發(fā)酵上清液經(jīng)70%硫酸銨沉淀、SephadexG-25脫鹽和Sephadex75層析三個步驟,獲得電泳純的堿性蛋白酶,純化倍數(shù)6.8倍,比活2200U/mg,產(chǎn)率39%,經(jīng)12%SDS-PAGE和質(zhì)譜檢測目的蛋白分子量為26.... 

【文章來源】：山西大學山西省

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

MEROPS數(shù)據(jù)庫中絲氨酸蛋白酶家族中胰蛋白酶家族和枯草桿菌蛋白酶家族中典型的蛋白酶成熟肽結(jié)構(gòu)對比

第一章綜述7圖1.2生物催化工藝開發(fā)策略[31-33]Figure1.2Biocatalyticprocessdevelopmentstrategies.1.4.1菌種的篩選和改良在用于工業(yè)領域中的微生物中，芽孢桿菌屬是生產(chǎn)堿性蛋白酶的主要來源。芽孢桿菌屬是細菌中最古老和最多樣化的屬類[34]，屬于兼性厭氧或需氧的革蘭氏陽性菌，桿狀，有內(nèi)生孢子形成，基因組大小介于3.35Mb和5.5Mb之間，GC含量35%-46%，其特征具有多樣性[35]。芽孢桿菌屬的一個重要的工業(yè)應用是酶的生產(chǎn)，包括脂肪酶、碳水化合物活性酶、蛋白酶等，其中蛋白水解酶占有重要的作用[36]。芽孢桿菌具有生長迅速、發(fā)酵周期短、分泌大量蛋白至胞外培養(yǎng)基的優(yōu)點，在工業(yè)上是一種重要的生產(chǎn)菌種，大多數(shù)芽孢桿菌向培養(yǎng)基中分泌的絲氨酸蛋白酶，被廣泛應用于食品、飲料、皮革、制藥、醫(yī)療和洗滌工業(yè)領域[37]。美國食品和藥品管理局已將枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌授予GRAS（公認安全）狀態(tài)。盡管基因工程和蛋白質(zhì)工程改變了蛋白質(zhì)的性質(zhì)，但仍不可能獲得完全理想的微生物蛋白酶。生物多樣性是生物技術創(chuàng)新的寶貴資源，對于尋找工業(yè)中使用的理想菌種起著關鍵作用。南北極、鹽堿地或者火山深海這些極端環(huán)境中分離的微生物產(chǎn)生的酶可能具有一些天然適合工業(yè)使用的性質(zhì)。每年大約有十種新的野生型subtilisin出現(xiàn)在專利或文獻中[29,38,39]，除了經(jīng)典的微生物篩選方法外，還通過全基因組篩選新特征的酶[37]。但菌種改良自始至終在微生物發(fā)酵工藝的商業(yè)開發(fā)中發(fā)揮著關鍵作用。通常，野生菌的產(chǎn)酶量是有限的，然而在很多情況下，選擇一些簡單的方法例如在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，有可能挑選出產(chǎn)量大幅度

第二章枯草桿菌蛋白酶BAPB92重組表達及純化27pBE2R-F2pBE2R-R2模板2ddH2O1.9dNTP1EasyTaqDNAPolymerase0.1圖2.1pBE2R-Bapb92表達載體構(gòu)建過程質(zhì)粒圖譜Figure2.1PlasmidmapofconstructionofexpressionvectorpBE2R-Bapb922.3.2BAPB92的表達（1）重組質(zhì)粒pBE2R-Bapb92的轉(zhuǎn)化BacillussubtilisWB600感受態(tài)的制備是使用Spizizen創(chuàng)立的方法經(jīng)過一定改進得來的[7,11-15]：首先將活化后的單菌落接種于GMⅠ中，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD=0.6~0.8；在GMII溶液中接種10%的GMⅠ菌液，37℃培養(yǎng)至OD=0.3~0.4；將菌液冰浴30min后低速離心（5000rpm）棄上清，加入10mLGMⅢ分裝后保存在-80℃冰箱中。將測序正確的質(zhì)粒5μL轉(zhuǎn)入BacillussubtilisWB600感受態(tài)細胞中，37℃，200rpm培養(yǎng)90min后涂布在含有卡那霉素抗性（40μg/mL）的牛奶平板（蛋白胨1%，NaCl1%，酵母提取物0.5%，牛奶2%，瓊脂粉1.5%，pH7.0[7,11]）上，于37℃培養(yǎng)24h，獲得重組BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92，根據(jù)透明圈初步判斷是否產(chǎn)生蛋白酶[7,16]。（2）BacillussubtilisWB600/pBE2R-Bapb92蛋白酶的發(fā)酵

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]發(fā)酵大豆中產(chǎn)堿性蛋白酶菌株鑒定及其部分酶學性質(zhì)研究[J]. 魏婷婷,周桂旭,石亞偉.  山西大學學報(自然科學版). 2019(01)
[3]響應面法優(yōu)化短小芽孢桿菌SCU11發(fā)酵產(chǎn)堿性蛋白酶及關鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析[J]. 尹萌萌,賀婷停,王超,宋婷,王海燕.  應用與環(huán)境生物學報. 2016(03)
[4]微生物利用油茶籽油工藝水產(chǎn)堿性蛋白酶初探[J]. 蘇悟,鄭小芬,徐睿烜,蔣立文,郭華,周建平.  中國糧油學報. 2016(03)
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碩士論文
[1]產(chǎn)堿性蛋白酶菌株BN-2的鑒定及其重組酶的酶學性質(zhì)表征[D]. 魏婷婷.山西大學 2019
[2]畢赤酵母和枯草桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的對比研究[D]. 王境.山西大學 2019
[3]提取分離枯草芽孢桿菌中性蛋白酶生產(chǎn)工藝的研究[D]. 趙素珍.齊魯工業(yè)大學 2017
[4]大腸桿菌—枯草芽孢桿菌穿梭表達載體pBE2R的構(gòu)建及應用[D]. 梁曉梅.天津科技大學 2011



本文編號：3238299