普魯蘭酶作為一種淀粉脫支酶可以高效催化普魯蘭糖、支鏈淀粉等底物中α-1,6-糖苷鍵的水解,在食品加工、生物能源、制藥及化工等領域有廣泛的應用。目前,盡管有很多研究集中于挖掘新的催化性能良好的普魯蘭酶,或?qū)ΜF(xiàn)有的普魯蘭酶進行分子改造以適應淀粉糖化工藝的條件。但是,理想的符合工業(yè)生產(chǎn)特性的普魯蘭酶,特別是可以用于淀粉冷水解工藝的普魯蘭酶非常少。隨著淀粉水解技術的不斷革新,淀粉深加工領域的不斷拓展,篩選具備優(yōu)良催化性能的普魯蘭酶對于優(yōu)化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,加強淀粉生物質(zhì)資源的開發(fā)利用具有重要意義。本研究分析了嗜溫菌Bacillus methanolicus PB1的基因組信息,找到一段候選普魯蘭酶基因（pul PB1）,在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了該基因的異源表達,并研究了相關的酶學性質(zhì)。依據(jù)生物信息學的手段對該普魯蘭酶（PulPB1）的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)組成進行分析,基于蛋白質(zhì)工程技術研究其N末端結(jié)構(gòu)域在酶分子催化過程中的作用,并通過定點突變技術對該普魯蘭酶進行分子改造,提高了熱穩(wěn)定性。主要研究結(jié)果如下:1.將Bacillus methanolicus PB1基因組中的普魯蘭酶基因克隆至載體p... 

【文章來源】：華南理工大學廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同來源的普魯蘭酶結(jié)構(gòu)示意圖

第一章緒論5圖1-2Ⅰ型普魯蘭酶催化多糖水解示意圖（A）支鏈淀粉；（B）普魯蘭糖Fig.1-2SchematicdiagramofthehydrolysisofpullulanandamylopectinbytypeIpullulanase1.3普魯蘭酶的性質(zhì)與應用1.3.1普魯蘭酶的性質(zhì)研究報道的普魯蘭酶大多來源于嗜溫菌，最適溫度大部分都在50℃以上，穩(wěn)定性較差；少部分的普魯蘭酶來源于嗜熱菌，最適溫度在75℃左右，穩(wěn)定性相對較好，但酶活偏低[13]（表1-2）。普魯蘭酶的最適反應pH的分布范圍為4.5–9.0，多數(shù)為5.0–6.5。目前，工業(yè)上在淀粉糖化時使用的多為酸性普魯蘭酶，例如，丹麥諾維信公司從嗜酸芽孢桿菌Bacillusacidopullulyticus中挖掘到的一種耐酸耐熱的普魯蘭酶，最適pH在4.5–5.0之間，最適溫度60℃[36,37]。由于其最適反應條件與糖化酶十分接近，催化效率與穩(wěn)定性也比較好，因此被開發(fā)為商品酶應用于淀粉糖化過程。部分研究報道的冷適應型普魯蘭酶，最適溫度在45℃左右，在淀粉冷水解工藝（又稱生淀粉水解工藝：省去高溫蒸煮糊化等程序，直接對生淀粉進行水解的方法）中具備一定的應用潛力，如表1-2中所示，來源于Bacilluspseudofirmus703及Exiguobacteriumsp.SH3的普魯蘭酶Pul703與Pul-SH3，最適溫度均為45℃，且Pul703酶活達270U/mg。但是，冷適應型普魯蘭酶的最適pH往往為中性或弱堿性，與其他糖化酶所適合的弱酸（A）（B）

第二章BacillusmethanolicusPB1普魯蘭酶在大腸桿菌中的克隆表達及酶學性質(zhì)研究23（16℃、20℃、25℃、30℃、37℃）和誘導時間（12、16、20、24、28h）對表達的重組普魯蘭酶活力的影響。其中菌液濃度測定（OD600）：使用沒有接種的LB培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，將菌液適當稀釋至吸光度在0.2–0.8之間，用紫外分光光度計測定其在600nm處的吸光值。細胞濕重測定（DCW，g/L）：將誘導表達后的發(fā)酵液50mL置于稱重后的離心管中，4℃，8000r/min離心5min棄去上清液，稱量收集到的菌體質(zhì)量，計算獲得的菌體濕重。2.3.6重組蛋白的分離純化2.3.6.1鎳柱親和層析純化誘導表達后的菌體進行超聲破碎得到普魯蘭酶粗酶液，用0.22μm的濾頭過濾，然后利用伯樂蛋白純化儀進行純化。使用購于GE的5mL鎳離子親和層析柱，具體方法見操作說明書。2.3.6.2蛋白濃度及純度的測定純化得到的普魯蘭酶液采用Brad-Ford法測定蛋白濃度，首先以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線，如圖2-1所示。然后測定蛋白樣品吸光值，根據(jù)標準曲線計算其濃度。具體的操作步驟見試劑盒說明書。圖2-1牛血清蛋白濃度標準曲線Fig.2-1ThestandardcurveofBrad-FordmethodbasedonBSASDS-PAGE用于鑒定蛋白質(zhì)純度。具體操作如下：1．凝膠根據(jù)下表配制：

【參考文獻】：
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碩士論文
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[3]普魯蘭酶的重組表達、發(fā)酵優(yōu)化及其在海藻糖制備中的應用[D]. 楊向會.江南大學 2018
[4]重組普魯蘭酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達[D]. 王海.華南理工大學 2018
[5]生淀粉酶酶解高濃度玉米淀粉乳的研究[D]. 房丹.江南大學 2016
[6]普魯蘭酶基因挖掘、酶學性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域進化研究[D]. 陳思齊.華東理工大學 2016
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