中性蛋白酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶,在食品、生物和醫(yī)藥等方面得到廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)從自然發(fā)酵的霉豆瓣中分離篩選出一株高產(chǎn)中性蛋白酶的菌株米曲霉Y1,通過硫酸銨鹽析、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析兩種純化方法獲得電泳級純度的中性蛋白酶,研究發(fā)現(xiàn)常見金屬離子能提高中性蛋白酶的酶活,其中以Cu²⁺激活效果最強(qiáng),通過單因素試驗(yàn)篩選出Cu²⁺最適作用濃度,進(jìn)一步探討了添加Cu²⁺對中性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的影響,并探討Cu²⁺對米曲霉Y1生長和產(chǎn)酶情況的影響。主要研究結(jié)果如下:（1）傳統(tǒng)自然發(fā)酵的霉豆瓣作為本試驗(yàn)菌株的樣品來源,試驗(yàn)共分離得到18株菌,有6株菌在中性酪蛋白培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈,其中菌株Y1水解圈直徑與菌落直徑的比值最大,為2.54,其中性蛋白酶的酶活最高,為342.42U/mL。通過形態(tài)學(xué)對菌株Y1進(jìn)行初步鑒定,采用18S rDNA片段擴(kuò)增后進(jìn)行序列測定,將序列測定結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析確定菌株Y1是米曲霉（Aspergillus oryzae）。（2）將米曲... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白酶優(yōu)勢菌株分離、篩選和鑒產(chǎn)中性蛋白酶菌株的分離篩選的半成品，其發(fā)酵過程屬于多菌株復(fù)合發(fā)紅曲霉和酵母菌[83-86]等真菌，本試驗(yàn)使用中分離得到 18 株菌，通過中性蛋白酶培養(yǎng)初篩從中性蛋白酶培養(yǎng)基上挑選出透明圈 Y2。使用點(diǎn)植法將兩株菌分別接入中性蛋別測定菌落直徑和透明圈直徑，結(jié)果見表水解情況。

圖 4 硫酸銨分級沉淀上清液的水解情況hydrolysis of the supernatant precipitated by ammoniumarose Fast Flow 離子交換層析和聚乙二醇 20000 濃縮后的蛋白酶樣品，利用換層析進(jìn)一步純化，洗脫圖譜見圖 5。褐色，經(jīng)過硫酸銨鹽析、透析除鹽和濃縮后的素，先用 pH 值為 7.0 的 Tris-HCl 緩沖液對其和雜蛋白。從樣品進(jìn)入填料開始，觀察到大約該峰出現(xiàn)在 NaCl 洗脫液洗脫之前，屬于流出透明，大約從 60min 開始收集管內(nèi)的收集液顏到褐色色素從上往下移動直至完全洗脫出來，吸收峰，此時(shí) NaCl 溶液洗脫濃度達(dá)到 1.6mol脫濃度達(dá)到 2.0mol/mL時(shí)，峰 2 出峰完全，

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[6]豆瓣醬生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究[D]. 劉志偉.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[7]淀粉液化芽孢桿菌BS5582中性蛋白酶的研究[D]. 萬巖松.江南大學(xué) 2012
[8]高產(chǎn)中性蛋白酶枯草桿菌的誘變選育、液體酶制備及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 陳文潔.蘭州理工大學(xué) 2011
[9]芽孢桿菌N19中性蛋白酶發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 劉東旺.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
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本文編號：3116749