(R)-1-（1-萘基）乙胺是合成擬鈣劑藥物鹽酸西那卡塞的關鍵手性中間體,生物合成（R）-1-（1-萘基）乙胺的方法更加綠色環(huán)保,因而受到越來越多的關注。其中,ω-轉氨酶（ω-transaminase）不對稱還原前手性酮制備手性胺具有很多優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.KNK168）來源的ω-轉氨酶ArATA可以不對稱還原1-萘乙酮合成（R）-1-（1-萘基）乙胺,且具有良好的立體選擇性（99%,R）,但其催化活力較低,難以實現(xiàn)工業(yè)化應用。因此,通過分子改造提高ArATA對1-萘乙酮的催化活力,主要研究內(nèi)容和結果如下:采用隨機突變和半理性設計相結合的策略。一方面,通過易錯PCR構建隨機突變文庫,同時建立適用于1-萘乙酮為底物的ω-轉氨酶高通量篩選方法,篩選到活力提升的突變體F225M、G136I、C281I和T282S;另一方面,根據(jù)晶體結構（PDB:3WWI）進行底物對接分析,通過對底物結合口袋中16個位點進行保守性分析,發(fā)現(xiàn)V69、W156、W192、G224和A284高度保守。對剩余11個位點進行丙氨酸掃描并對G136、V199和S223點進行定點飽和突... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

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(R)-1-(1-萘基)乙胺用于合成鹽酸西那卡塞Figure1-2(R)-(+)-1-(1-naphthyl)ethylamineusedinthesynthesisofcinacalcethydrochloride

技術路線

江南大學碩士學位論文18第三章結果與討論3.1轉氨酶庫的篩選3.1.1重組轉氨酶的構建根據(jù)文獻報道，使用ω-轉氨酶作為生物催化劑不對稱合成手性胺是一種廣泛應用的制備方法，因此為了制備光學純(R)-1-(1-萘基)乙胺，選擇R-選擇性ω-轉氨酶作為生物催化劑是一種具有應用價值的方法。ArATA是來源于Arthrobactersp.KNK168的R-選擇性ω-轉氨酶，對(R)-1-(1-萘基)乙胺有催化活力[32]，能夠催化外消旋1-(1-萘基)乙胺生成1-萘乙酮和(S)-1-(1-萘基)乙胺，并且轉化率能達到50%，ee>99%。根據(jù)轉氨酶催化反應的逆反應，ArATA能夠催化1-萘乙酮生成(R)-1-(1-萘基)乙胺。由于基因挖掘時一般選擇相對于模板同源性在30~80%的酶序列，將ArATA在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)在同源性30~80%的轉氨酶序列中，有3個酶的基因來源可在本實驗室保藏的野生菌中找到，分別是地衣形芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）、抑制暗棕色桿菌（Phaeobacterinhibens）和高盧根瘤菌（Rhizobiumgallicum）。因此，擬將這四種轉氨酶構建出來，用于篩選能夠催化1-萘乙酮的轉氨酶。首先對Bacilluslicheniformis、Phaeobacterinhibens和Rhizobiumgallicum分別使用營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基、根瘤菌培養(yǎng)基進行活化，使用細菌基因組提取試劑盒提取基因組，并進行凝膠核酸電泳檢測，電泳分析結果如下圖3-1所示：圖3-1基因組DNA電泳圖Figure3-1AgarosegelelectrophoresisofgenomicDNA注：M：Marker；1：Rhizobiumgallicum；2：Phaeobacterinhibens；3：Bacilluslicheniformis以基因組DNA為模板，使用附錄1中P1和P2為引物對目的基因片段進行PCR擴增并進行純化回收，目的基因片段大小約為1000bp，如圖3-2所示：

【參考文獻】：
期刊論文
[1]蛋白質工程：從定向進化到計算設計[J]. 曲戈,朱彤,蔣迎迎,吳邊,孫周通.  生物工程學報. 2019(10)
[2]ω-轉氨酶分子改造研究進展[J]. 高新星,韋平和.  生物工程學報. 2018(07)
[3]手性1-（1-萘基）乙胺的制備及其藥物應用最新進展[J]. 盧定強,夏芙潔,王琦,孫生柏,凌岫泉.  現(xiàn)代化工. 2014(05)
[4]胺基裂解酶及其在醫(yī)藥中間體生產(chǎn)中的應用[J]. 何碧波,陳小龍,鄭裕國,沈寅初.  微生物學通報. 2008(07)

碩士論文
[1]細菌耐丁醇元件的挖掘及大腸桿菌的溶劑耐受性研究[D]. 肖琳.江南大學 2019
[2]氨基酸脫氫酶的基因挖掘、定向改造及合成手性氨基酸的研究[D]. 程軍.江南大學 2017



本文編號：3102243