α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,α-KG）是一種二元短鏈羧酸,也是連接碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點,是微生物體內(nèi)多種化合物的重要前體,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、精細化工等領(lǐng)域。目前,α-KG的生產(chǎn)制備方法主要有化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶催化轉(zhuǎn)化法。其中,化學合成法使用大量有害試劑,嚴重污染環(huán)境且限制其在食品等行業(yè)的應(yīng)用。微生物發(fā)酵法存在副產(chǎn)物過多,發(fā)酵周期長等弊端。酶催化轉(zhuǎn)化法具有催化反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)副產(chǎn)物少,產(chǎn)物易分離等優(yōu)點,適合α-KG的生產(chǎn)。本研究利用異源表達來源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因（pm1）的E.coli BL21（DE3）重組菌株催化底物L-谷氨酸鈉合成產(chǎn)物α-KG,并從分子改造、表達載體優(yōu)化、搖瓶和罐上發(fā)酵及全細胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化等方面提高L-氨基酸脫氨酶合成α-KG的效率。論文主要內(nèi)容如下:（1）將異源表達來源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因pm1的重組大腸桿菌E.coli BL21（pET20b-pm1）進行搖瓶上的發(fā)酵和全細胞轉(zhuǎn)化的條件優(yōu)化。確定最佳發(fā)酵條件為:種子培養(yǎng)時間10 h,誘... 

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

α-KG的結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Thestereochemicalstructureofα-ketoglutarate

酶作用位置是胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)組成包括：FAD 結(jié)合域、帽子、螺旋Sulfolobus tokodaii 的 L-氨基酸脫氨酶作用位置是胞質(zhì)，結(jié)構(gòu)組帽子、螺旋域[36]；來源于普通變形桿菌 Proteus vulgaris 的 L-氨上胞外，結(jié)構(gòu)組成包括 FAD 結(jié)合域、底物結(jié)合域、α+β 結(jié)構(gòu)域 Proteus myxofaciens 的 L-氨基酸脫氨酶作用位置是膜上胞外[3氨酶催化的反應(yīng)為氧化脫氨反應(yīng)，根據(jù)產(chǎn)物是否存在 H2O2可類：一類產(chǎn)生 H2O2；另一類產(chǎn)生水。產(chǎn)生 H2O2的 L-氨基酸脫酸 Cα上的 H 轉(zhuǎn)移到輔酶 FAD 上，氨基酸在水分子的作用下通的 α-酮酸和氨；FAD 獲得 H 后形成 FADH2，而后被氧分子氧形成 H2O2。產(chǎn)生水的 L-氨基酸脫氨酶催化過程的不同之處是胞膜上的電子傳遞鏈傳遞至細胞色素蛋白，氧分子被還原成水]。催化過程如圖 1-2 所示。產(chǎn)生水的一類 L-氨基酸脫氨酶由于對細胞生長影響小，相比下更利于在大腸桿菌等常用菌株中的中利用 L-氨基酸氨基酸脫氨酶催化 L-谷氨酸生成 α-KG 的反應(yīng)

圖 1-2 L-氨基酸脫氨酶的氧化還原反應(yīng)類型Fig.1-2 The Oxidative deamination of L-amino acid deaminase

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]L-氨基酸脫氨酶分子改造及生物合成α-酮異己酸[D]. 宋陽.江南大學 2018
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碩士論文
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[3]α-酮戊二酸工程菌構(gòu)建及發(fā)酵條件控制[D]. 馮甲.天津科技大學 2015



本文編號：3097937