利用儲量豐富且可再生的食品和農業(yè)廢棄物生產(chǎn)生物基能源和化學品具有重要的經(jīng)濟、環(huán)保價值。現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中的主要瓶頸是缺乏高效的木質纖維素降解酶和高效、經(jīng)濟的產(chǎn)品生產(chǎn)工藝。木質纖維素降解酶主要包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木質素降解酶,其中果膠酶,長期以來被認為是一類不重要的輔酶,被嚴重低估。此外,纖維二糖酸,是一種高附加值但目前產(chǎn)能較低的有機酸,具有重要經(jīng)濟價值。因此,為了發(fā)掘高效、新穎木質纖維素降解酶及降低纖維二糖酸生產(chǎn)工藝成本,本研究主要通過構建具有高效木質纖維素降解能力的堆肥生境并進行宏基因組學分析,挖掘新穎木質纖維素降解酶并研究其在纖維二糖酸生產(chǎn)中的作用,并進一步探索統(tǒng)合生物加工生產(chǎn)纖維二糖酸中預處理工藝。論文的主要研究內容和結果如下:1.高效木質纖維素降解堆肥生境的構建及宏基因組學分析通過定向富集培養(yǎng)技術,構建了具有高效木質纖維素降解能力的堆肥體系（apple pomace-adapted compost microbial community,APACMC）。在富集培養(yǎng)過程中,堆肥體系的最高溫度達68℃,呈現(xiàn)出堆肥典型的升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期四個階段;16S r D... 

【文章來源】：西北農林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 木質纖維素生物質
        1.1.1 木質纖維素生物質的基本結構
        1.1.2 果膠在木質纖維素中的作用
        1.1.3 木質纖維素生物質能源生產(chǎn)的瓶頸
    1.2 木質纖維素降解酶
        1.2.1 纖維素水解酶
        1.2.2 裂解性多糖單加氧酶
        1.2.3 纖維二糖脫氫酶
        1.2.4 半纖維素酶
        1.2.5 果膠酶
        1.2.6 木質素降解酶——漆酶
    1.3 宏基因組學技術在挖掘木質纖維素降解酶中的應用
        1.3.1 宏基因組學
        1.3.2 木質纖維素降解酶的宏基因組挖掘
    1.4 統(tǒng)合生物加工生產(chǎn)纖維二糖酸
        1.4.1 纖維二糖酸
        1.4.2 Neurospora crassa工程菌
        1.4.3 LPMO、CDH、漆酶、GMC氧化還原酶、木質素與纖維素之間的關系
    1.5 本文研究意義及主要研究內容
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 研究內容及技術路線圖
第二章 木質纖維素降解堆肥生境的構建及宏基因組學分析
    2.1 試驗材料與設備
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 主要試劑及耗材
        2.1.3 主要儀器與設備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 蘋果渣生物質降解微生物在堆肥環(huán)境中的富集
        2.2.2 堆肥的物理化學性質分析
        2.2.3 16S rDNA基因高通量測序和物種系統(tǒng)分類
        2.2.4 宏基因組測序,de novo序列組裝和開放閱讀框預測
        2.2.5 序列提交
    2.3 結果與討論
        2.3.1 堆肥進程中理化性質的變化
        2.3.2 堆肥進程中微生物群落結構的變化
        2.3.3 APACMC宏基因組中的微生物多樣性分析
        2.3.4 APACMC宏基因組中預測基因的功能基因分類
        2.3.5 APACMC宏基因組中碳水化合物活性酶的多樣性、豐度和微生物來源
    2.4 小結
第三章 纖維素降解酶、半纖維素降解酶和木質素降解酶的宏基因組學挖掘
    3.1 試驗材料與設備
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 主要試劑及耗材
        3.1.3 主要儀器與設備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 木質纖維素生物質降解微生物在堆肥生境中的富集效果的評判
        3.2.2 纖維素酶活和半纖維素酶活的測定
        3.2.3 木質纖維素降解酶基因的注釋
        3.2.4 木質素降解基因的準確注釋
        3.2.5 特定的纖維素、半纖維素和木質素降解基因:注釋及系統(tǒng)發(fā)育樹分析
    3.3 結果與討論
        3.3.1 富集的微生物纖維素降解能力的初級評判
        3.3.2 纖維素酶活和半纖維素酶活的測定
        3.3.3 APACMC宏基因組中木質纖維素降解微生物組成分析
        3.3.4 APACMC宏基因組中木質纖維素降解代謝潛能分析
        3.3.5 木質纖維素降解酶的挖掘
        3.3.6 木質纖維素降解微生物的挖掘
        3.3.7 需重點關注的木質纖維素降解酶及微生物
    3.4 小結
第四章 宏基因組學挖掘果膠降解菌、果膠酶及嗜熱果膠酶的分離、純化和表征
    4.1 試驗材料與設備
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 主要試劑及耗材
        4.1.3 主要儀器設備
    4.2 試驗方法
        4.2.1 果膠降解微生物在堆肥生境中的富集效果的評判
        4.2.2 特定果膠酶降解基因:基因注釋和系統(tǒng)發(fā)育分析
        4.2.3 果膠酶活的測定
        4.2.4 嗜熱果膠降解微生物的篩選分離
        4.2.5 嗜熱果膠降解微生物的鑒定
        4.2.6 編碼果膠酶基因序列的克隆、驗證及測序
        4.2.7 編碼果膠酶的氨基酸序列比對、生物信息學分析及其三維結構模擬
        4.2.8 果膠酶的分離純化
        4.2.9 溫度、pH、金屬離子和化學試劑對酶的影響
        4.2.10 底物特異性和酶促動力學參數(shù)的測定
    4.3 結果與討論
        4.3.1 富集微生物的果膠降解能力的初級評判
        4.3.2 參與果膠降解的特定COG功能分類分析
        4.3.3 果膠降解酶的挖掘
        4.3.4 果膠降解微生物的挖掘
        4.3.5 嗜熱果膠降解微生物的分離
        4.3.6 嗜熱細菌來源的果膠降解酶的基因克隆與測序
        4.3.7 果膠酸裂解酶的純化及分子量的確定
        4.3.8 果膠酸裂解酶BsPel-Z10 的酶學特性
        4.3.9 金屬離子和化學試劑對BsPel-Z10 酶活的影響
        4.3.10 BsPel-Z10 的底物特異性和酶動力學參數(shù)測定
    4.4 小結
第五章 五個宏基因組來源的新穎木質纖維素降解酶的異源表達及分析
    5.1 試驗材料與設備
        5.1.1 試驗載體與菌株
        5.1.2 工具酶和試劑盒
        5.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基
        5.1.4 主要儀器及設備
    5.2 試驗方法
        5.2.1 新穎木質纖維素降解酶基因的驗證及篩選
        5.2.2 新穎木質纖維素降解酶基因的分析及合成
        5.2.3 重組質粒的構建及驗證
        5.2.4 基因工程菌E.coli BL21 的構建及鑒定
        5.2.5 重組工程菌誘導表達獲得重組酶
        5.2.6 重組酶的分離純化
        5.2.7 重組酶的蛋白電泳SDS-PAGE檢測
        5.2.8 LPMO與銅離子的結合
        5.2.9 重組酶的酶活測定
        5.2.10 重組酶蛋白含量測定
        5.2.11 重組酶系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白結構的同源建模與分析
    5.3 結果與討論
        5.3.1 LPMO10-297291的序列分析
        5.3.2 CE15-3258的序列分析
        5.3.3 Lac-4805的序列分析
        5.3.4 GH43-5749的序列分析
        5.3.5 PL11-18811的序列分析
        5.3.6 重組質粒、基因工程菌的構建及驗證
        5.3.7 重組酶的誘導表達、純化及酶活測定
        5.3.8 重組酶的同源建模及結構和催化活性位點分析
    5.4 小結
第六章 漆酶、纖維二糖脫氫酶和木質素在纖維二糖酸生產(chǎn)中的協(xié)同作用
    6.1 試驗材料與設備
        6.1.1 試驗菌株
        6.1.2 主要試劑、耗材及培養(yǎng)基
        6.1.3 主要儀器及設備
    6.2 試驗材料及方法
        6.2.1 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 種子的制備
        6.2.2 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 體內發(fā)酵試驗
        6.2.3 纖維二糖脫氫酶的制備及純化
        6.2.4 漆酶的制備及純化
        6.2.5 纖維二糖脫氫酶和漆酶酶活及濃度的測定
        6.2.6 小麥秸稈原料的制備
        6.2.7 酶解木質素的制備
        6.2.8 CDH-漆酶無細胞體系將纖維二糖轉化為纖維二糖酸的體外試驗
        6.2.9 纖維二糖酸標品的制備及標定
        6.2.10 纖維二糖、纖維二糖酸、葡萄糖和葡萄糖酸濃度的測定
        6.2.11 木質素對CDH和漆酶酶活的影響
        6.2.12 木質纖維素組分測定
        6.2.13 停流光譜儀監(jiān)測CDH與漆酶之間的電子傳遞
        6.2.14 電子順磁共振光譜技術測定木質素自由基的形成及消耗
        6.2.15 數(shù)據(jù)處理
    6.3 結果與討論
        6.3.1 CDH、漆酶酶活及纖維二糖酸標品濃度
        6.3.2 外源添加氧化還原介體對N.crassa HL10 高產(chǎn)纖維二糖酸的必要性
        6.3.3 N.crassa HL10 直接從Avicel和小麥秸稈中生產(chǎn)纖維二糖酸的比較
        6.3.4 木質素對N.crassa HL10將Avicel轉化為纖維二糖酸的影響
        6.3.5 木質素對CDH-漆酶無細胞體系將纖維二糖轉化為纖維二糖酸的影響
        6.3.6 木質素對CDH和漆酶酶活的影響
        6.3.7 CDH-木質素-漆酶體系的潛在機制
        6.3.8 EPR監(jiān)測木質素自由基產(chǎn)生及消耗
        6.3.9 停流光譜儀監(jiān)測CDH與漆酶之間的電子傳遞
    6.4 小結
第七章 工程菌N.crassa直接從小麥秸稈中統(tǒng)合生產(chǎn)纖維二糖酸
    7.1 試驗材料與設備
        7.1.1 試驗菌株
        7.1.2 主要試劑、耗材及培養(yǎng)基
        7.1.3 主要儀器設備
    7.2 試驗方法
        7.2.1 小麥秸稈的三種預處理
        7.2.2 三種從預處理小麥秸稈木質素的制備
        7.2.3 木質纖維素組分測定及木質素的測定
        7.2.4 CDH和漆酶的制備、純化及酶活測定
        7.2.5 N.crassa HL10 種子的制備
        7.2.6 不同預處理小麥秸稈的N.crassa HL10 發(fā)酵
        7.2.7 三種木質素對N.crassa HL10 生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.2.8 三種木質素對CDH-漆酶無細胞體系生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.2.9 纖維二糖和纖維二糖酸的檢測
        7.2.10 木質素和酚類物質含量測定
        7.2.11 三種預處理小麥秸稈及其相應木質素的傅里葉紅外光譜
        7.2.12 三種預處理小麥秸稈的X射線衍射分析
        7.2.13 凝膠滲透色譜對三種木質素分子量的測定
        7.2.14 香草醛、丁香醛和阿魏酸對CDH-漆酶無細胞體系產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.2.15 數(shù)據(jù)處理
    7.3 結果與討論
        7.3.1 不同預處理對小麥秸稈中各組分的影響
        7.3.2 三種預處理小麥秸稈統(tǒng)合生物加工生產(chǎn)纖維二糖酸能力比較
        7.3.3 三種木質素對N.crassa HL10以Avicel為底物生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.3.4 三種木質素對CDH-漆酶無細胞體系生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.3.5 三種預處理小麥秸稈及其制備的相應木質素的FTIR分析
        7.3.6 三種預處理小麥秸稈的XRD特性
        7.3.7 三種木質素的分子大小及分布比較
        7.3.8 香草醛、丁香醛和阿魏酸在CDH-漆酶無細胞體系生產(chǎn)中纖維二糖酸的作用
        7.3.9 N.crassa HL10 從堿預處理小麥秸稈中統(tǒng)合生產(chǎn)纖維二糖酸工藝的初步構建
    7.4 小結
第八章 結論、創(chuàng)新點與展望
    8.1 結論
    8.2 創(chuàng)新點
    8.3 展望
參考文獻
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Actinosynnema mirum DSM43827溶解性多糖單加氧酶的異源表達和酶學性質表征[J]. 施賢衛(wèi),張偉濤,張小飛,楊廣宇,馮雁.  中國生物工程雜志. 2014(07)

博士論文
[1]堆肥過程N2O減排控制與木質纖維素降解微生物學機理研究[D]. 王成.浙江大學 2014
[2]木質纖維素降解菌產(chǎn)糖特性及作用機制[D]. 高靈芳.哈爾濱工業(yè)大學 2013
[3]果膠酶基因的克隆表達及其在小尾寒羊瘤胃環(huán)境中的多樣性分析[D]. 苑鵬.中國農業(yè)科學院 2012

碩士論文
[1]真菌果膠酶性質分析及分子改良[D]. 潘霞.中國農業(yè)科學院 2014
[2]木質素降解過程中纖維二糖脫氫酶和漆酶協(xié)同作用的初步研究[D]. 李振華.山東大學 2009



本文編號：3048166