利用儲(chǔ)量豐富且可再生的食品和農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)生物基能源和化學(xué)品具有重要的經(jīng)濟(jì)、環(huán)保價(jià)值�，F(xiàn)有生產(chǎn)工藝中的主要瓶頸是缺乏高效的木質(zhì)纖維素降解酶和高效、經(jīng)濟(jì)的產(chǎn)品生產(chǎn)工藝。木質(zhì)纖維素降解酶主要包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和木質(zhì)素降解酶,其中果膠酶,長期以來被認(rèn)為是一類不重要的輔酶,被嚴(yán)重低估。此外,纖維二糖酸,是一種高附加值但目前產(chǎn)能較低的有機(jī)酸,具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此,為了發(fā)掘高效、新穎木質(zhì)纖維素降解酶及降低纖維二糖酸生產(chǎn)工藝成本,本研究主要通過構(gòu)建具有高效木質(zhì)纖維素降解能力的堆肥生境并進(jìn)行宏基因組學(xué)分析,挖掘新穎木質(zhì)纖維素降解酶并研究其在纖維二糖酸生產(chǎn)中的作用,并進(jìn)一步探索統(tǒng)合生物加工生產(chǎn)纖維二糖酸中預(yù)處理工藝。論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.高效木質(zhì)纖維素降解堆肥生境的構(gòu)建及宏基因組學(xué)分析通過定向富集培養(yǎng)技術(shù),構(gòu)建了具有高效木質(zhì)纖維素降解能力的堆肥體系（apple pomace-adapted compost microbial community,APACMC）。在富集培養(yǎng)過程中,堆肥體系的最高溫度達(dá)68℃,呈現(xiàn)出堆肥典型的升溫期、高溫期、降溫期和腐熟期四個(gè)階段;16S r D... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 木質(zhì)纖維素生物質(zhì)
        1.1.1 木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)
        1.1.2 果膠在木質(zhì)纖維素中的作用
        1.1.3 木質(zhì)纖維素生物質(zhì)能源生產(chǎn)的瓶頸
    1.2 木質(zhì)纖維素降解酶
        1.2.1 纖維素水解酶
        1.2.2 裂解性多糖單加氧酶
        1.2.3 纖維二糖脫氫酶
        1.2.4 半纖維素酶
        1.2.5 果膠酶
        1.2.6 木質(zhì)素降解酶——漆酶
    1.3 宏基因組學(xué)技術(shù)在挖掘木質(zhì)纖維素降解酶中的應(yīng)用
        1.3.1 宏基因組學(xué)
        1.3.2 木質(zhì)纖維素降解酶的宏基因組挖掘
    1.4 統(tǒng)合生物加工生產(chǎn)纖維二糖酸
        1.4.1 纖維二糖酸
        1.4.2 Neurospora crassa工程菌
        1.4.3 LPMO、CDH、漆酶、GMC氧化還原酶、木質(zhì)素與纖維素之間的關(guān)系
    1.5 本文研究意義及主要研究內(nèi)容
        1.5.1 研究意義
        1.5.2 研究內(nèi)容及技術(shù)路線圖
第二章 木質(zhì)纖維素降解堆肥生境的構(gòu)建及宏基因組學(xué)分析
    2.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑及耗材
        2.1.3 主要儀器與設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 蘋果渣生物質(zhì)降解微生物在堆肥環(huán)境中的富集
        2.2.2 堆肥的物理化學(xué)性質(zhì)分析
        2.2.3 16S rDNA基因高通量測(cè)序和物種系統(tǒng)分類
        2.2.4 宏基因組測(cè)序,de novo序列組裝和開放閱讀框預(yù)測(cè)
        2.2.5 序列提交
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 堆肥進(jìn)程中理化性質(zhì)的變化
        2.3.2 堆肥進(jìn)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化
        2.3.3 APACMC宏基因組中的微生物多樣性分析
        2.3.4 APACMC宏基因組中預(yù)測(cè)基因的功能基因分類
        2.3.5 APACMC宏基因組中碳水化合物活性酶的多樣性、豐度和微生物來源
    2.4 小結(jié)
第三章 纖維素降解酶、半纖維素降解酶和木質(zhì)素降解酶的宏基因組學(xué)挖掘
    3.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        3.1.1 試驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試劑及耗材
        3.1.3 主要儀器與設(shè)備
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解微生物在堆肥生境中的富集效果的評(píng)判
        3.2.2 纖維素酶活和半纖維素酶活的測(cè)定
        3.2.3 木質(zhì)纖維素降解酶基因的注釋
        3.2.4 木質(zhì)素降解基因的準(zhǔn)確注釋
        3.2.5 特定的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解基因:注釋及系統(tǒng)發(fā)育樹分析
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 富集的微生物纖維素降解能力的初級(jí)評(píng)判
        3.3.2 纖維素酶活和半纖維素酶活的測(cè)定
        3.3.3 APACMC宏基因組中木質(zhì)纖維素降解微生物組成分析
        3.3.4 APACMC宏基因組中木質(zhì)纖維素降解代謝潛能分析
        3.3.5 木質(zhì)纖維素降解酶的挖掘
        3.3.6 木質(zhì)纖維素降解微生物的挖掘
        3.3.7 需重點(diǎn)關(guān)注的木質(zhì)纖維素降解酶及微生物
    3.4 小結(jié)
第四章 宏基因組學(xué)挖掘果膠降解菌、果膠酶及嗜熱果膠酶的分離、純化和表征
    4.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        4.1.1 試驗(yàn)材料
        4.1.2 主要試劑及耗材
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 果膠降解微生物在堆肥生境中的富集效果的評(píng)判
        4.2.2 特定果膠酶降解基因:基因注釋和系統(tǒng)發(fā)育分析
        4.2.3 果膠酶活的測(cè)定
        4.2.4 嗜熱果膠降解微生物的篩選分離
        4.2.5 嗜熱果膠降解微生物的鑒定
        4.2.6 編碼果膠酶基因序列的克隆、驗(yàn)證及測(cè)序
        4.2.7 編碼果膠酶的氨基酸序列比對(duì)、生物信息學(xué)分析及其三維結(jié)構(gòu)模擬
        4.2.8 果膠酶的分離純化
        4.2.9 溫度、pH、金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶的影響
        4.2.10 底物特異性和酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 富集微生物的果膠降解能力的初級(jí)評(píng)判
        4.3.2 參與果膠降解的特定COG功能分類分析
        4.3.3 果膠降解酶的挖掘
        4.3.4 果膠降解微生物的挖掘
        4.3.5 嗜熱果膠降解微生物的分離
        4.3.6 嗜熱細(xì)菌來源的果膠降解酶的基因克隆與測(cè)序
        4.3.7 果膠酸裂解酶的純化及分子量的確定
        4.3.8 果膠酸裂解酶BsPel-Z10 的酶學(xué)特性
        4.3.9 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)BsPel-Z10 酶活的影響
        4.3.10 BsPel-Z10 的底物特異性和酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
    4.4 小結(jié)
第五章 五個(gè)宏基因組來源的新穎木質(zhì)纖維素降解酶的異源表達(dá)及分析
    5.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        5.1.1 試驗(yàn)載體與菌株
        5.1.2 工具酶和試劑盒
        5.1.3 主要試劑及培養(yǎng)基
        5.1.4 主要儀器及設(shè)備
    5.2 試驗(yàn)方法
        5.2.1 新穎木質(zhì)纖維素降解酶基因的驗(yàn)證及篩選
        5.2.2 新穎木質(zhì)纖維素降解酶基因的分析及合成
        5.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證
        5.2.4 基因工程菌E.coli BL21 的構(gòu)建及鑒定
        5.2.5 重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組酶
        5.2.6 重組酶的分離純化
        5.2.7 重組酶的蛋白電泳SDS-PAGE檢測(cè)
        5.2.8 LPMO與銅離子的結(jié)合
        5.2.9 重組酶的酶活測(cè)定
        5.2.10 重組酶蛋白含量測(cè)定
        5.2.11 重組酶系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白結(jié)構(gòu)的同源建模與分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 LPMO10-297291的序列分析
        5.3.2 CE15-3258的序列分析
        5.3.3 Lac-4805的序列分析
        5.3.4 GH43-5749的序列分析
        5.3.5 PL11-18811的序列分析
        5.3.6 重組質(zhì)粒、基因工程菌的構(gòu)建及驗(yàn)證
        5.3.7 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及酶活測(cè)定
        5.3.8 重組酶的同源建模及結(jié)構(gòu)和催化活性位點(diǎn)分析
    5.4 小結(jié)
第六章 漆酶、纖維二糖脫氫酶和木質(zhì)素在纖維二糖酸生產(chǎn)中的協(xié)同作用
    6.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        6.1.1 試驗(yàn)菌株
        6.1.2 主要試劑、耗材及培養(yǎng)基
        6.1.3 主要儀器及設(shè)備
    6.2 試驗(yàn)材料及方法
        6.2.1 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 種子的制備
        6.2.2 N.crassa F5ΔΔΔ和 HL10 體內(nèi)發(fā)酵試驗(yàn)
        6.2.3 纖維二糖脫氫酶的制備及純化
        6.2.4 漆酶的制備及純化
        6.2.5 纖維二糖脫氫酶和漆酶酶活及濃度的測(cè)定
        6.2.6 小麥秸稈原料的制備
        6.2.7 酶解木質(zhì)素的制備
        6.2.8 CDH-漆酶無細(xì)胞體系將纖維二糖轉(zhuǎn)化為纖維二糖酸的體外試驗(yàn)
        6.2.9 纖維二糖酸標(biāo)品的制備及標(biāo)定
        6.2.10 纖維二糖、纖維二糖酸、葡萄糖和葡萄糖酸濃度的測(cè)定
        6.2.11 木質(zhì)素對(duì)CDH和漆酶酶活的影響
        6.2.12 木質(zhì)纖維素組分測(cè)定
        6.2.13 停流光譜儀監(jiān)測(cè)CDH與漆酶之間的電子傳遞
        6.2.14 電子順磁共振光譜技術(shù)測(cè)定木質(zhì)素自由基的形成及消耗
        6.2.15 數(shù)據(jù)處理
    6.3 結(jié)果與討論
        6.3.1 CDH、漆酶酶活及纖維二糖酸標(biāo)品濃度
        6.3.2 外源添加氧化還原介體對(duì)N.crassa HL10 高產(chǎn)纖維二糖酸的必要性
        6.3.3 N.crassa HL10 直接從Avicel和小麥秸稈中生產(chǎn)纖維二糖酸的比較
        6.3.4 木質(zhì)素對(duì)N.crassa HL10將Avicel轉(zhuǎn)化為纖維二糖酸的影響
        6.3.5 木質(zhì)素對(duì)CDH-漆酶無細(xì)胞體系將纖維二糖轉(zhuǎn)化為纖維二糖酸的影響
        6.3.6 木質(zhì)素對(duì)CDH和漆酶酶活的影響
        6.3.7 CDH-木質(zhì)素-漆酶體系的潛在機(jī)制
        6.3.8 EPR監(jiān)測(cè)木質(zhì)素自由基產(chǎn)生及消耗
        6.3.9 停流光譜儀監(jiān)測(cè)CDH與漆酶之間的電子傳遞
    6.4 小結(jié)
第七章 工程菌N.crassa直接從小麥秸稈中統(tǒng)合生產(chǎn)纖維二糖酸
    7.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備
        7.1.1 試驗(yàn)菌株
        7.1.2 主要試劑、耗材及培養(yǎng)基
        7.1.3 主要儀器設(shè)備
    7.2 試驗(yàn)方法
        7.2.1 小麥秸稈的三種預(yù)處理
        7.2.2 三種從預(yù)處理小麥秸稈木質(zhì)素的制備
        7.2.3 木質(zhì)纖維素組分測(cè)定及木質(zhì)素的測(cè)定
        7.2.4 CDH和漆酶的制備、純化及酶活測(cè)定
        7.2.5 N.crassa HL10 種子的制備
        7.2.6 不同預(yù)處理小麥秸稈的N.crassa HL10 發(fā)酵
        7.2.7 三種木質(zhì)素對(duì)N.crassa HL10 生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.2.8 三種木質(zhì)素對(duì)CDH-漆酶無細(xì)胞體系生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.2.9 纖維二糖和纖維二糖酸的檢測(cè)
        7.2.10 木質(zhì)素和酚類物質(zhì)含量測(cè)定
        7.2.11 三種預(yù)處理小麥秸稈及其相應(yīng)木質(zhì)素的傅里葉紅外光譜
        7.2.12 三種預(yù)處理小麥秸稈的X射線衍射分析
        7.2.13 凝膠滲透色譜對(duì)三種木質(zhì)素分子量的測(cè)定
        7.2.14 香草醛、丁香醛和阿魏酸對(duì)CDH-漆酶無細(xì)胞體系產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.2.15 數(shù)據(jù)處理
    7.3 結(jié)果與討論
        7.3.1 不同預(yù)處理對(duì)小麥秸稈中各組分的影響
        7.3.2 三種預(yù)處理小麥秸稈統(tǒng)合生物加工生產(chǎn)纖維二糖酸能力比較
        7.3.3 三種木質(zhì)素對(duì)N.crassa HL10以Avicel為底物生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.3.4 三種木質(zhì)素對(duì)CDH-漆酶無細(xì)胞體系生產(chǎn)纖維二糖酸的影響
        7.3.5 三種預(yù)處理小麥秸稈及其制備的相應(yīng)木質(zhì)素的FTIR分析
        7.3.6 三種預(yù)處理小麥秸稈的XRD特性
        7.3.7 三種木質(zhì)素的分子大小及分布比較
        7.3.8 香草醛、丁香醛和阿魏酸在CDH-漆酶無細(xì)胞體系生產(chǎn)中纖維二糖酸的作用
        7.3.9 N.crassa HL10 從堿預(yù)處理小麥秸稈中統(tǒng)合生產(chǎn)纖維二糖酸工藝的初步構(gòu)建
    7.4 小結(jié)
第八章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望
    8.1 結(jié)論
    8.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    8.3 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
個(gè)人簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Actinosynnema mirum DSM43827溶解性多糖單加氧酶的異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)表征[J]. 施賢衛(wèi),張偉濤,張小飛,楊廣宇,馮雁.  中國生物工程雜志. 2014(07)

博士論文
[1]堆肥過程N(yùn)2O減排控制與木質(zhì)纖維素降解微生物學(xué)機(jī)理研究[D]. 王成.浙江大學(xué) 2014
[2]木質(zhì)纖維素降解菌產(chǎn)糖特性及作用機(jī)制[D]. 高靈芳.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 2013
[3]果膠酶基因的克隆表達(dá)及其在小尾寒羊瘤胃環(huán)境中的多樣性分析[D]. 苑鵬.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012

碩士論文
[1]真菌果膠酶性質(zhì)分析及分子改良[D]. 潘霞.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[2]木質(zhì)素降解過程中纖維二糖脫氫酶和漆酶協(xié)同作用的初步研究[D]. 李振華.山東大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3048166