尼莫克汀是由藍(lán)灰色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)的一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物,屬于米爾貝霉素族抗生素。尼莫克汀通常被用作農(nóng)用抗生素莫西克汀的合成前體,因其廣譜的抗害蟲特性,以及安全、高效,對人體無毒,對環(huán)境無害,不易產(chǎn)生抗藥性等一系列特點,莫西克汀被譽為21世紀(jì)最具前景的綠色生物農(nóng)藥。但是現(xiàn)如今在尼莫克汀生物合成的調(diào)節(jié)與控制方面鮮有研究,這對進(jìn)一步提高尼莫克汀產(chǎn)量以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化要求造成了巨大的障礙。為了解決這些問題,本文利用高通量方法建立并優(yōu)化了適合于尼莫克汀發(fā)酵的全合成培養(yǎng)基,并初步探索了不同補料工藝條件下藍(lán)灰色鏈霉菌的代謝情況以及尼莫克汀合成調(diào)控機(jī)理。首先,本文建立了菌體高通量培養(yǎng)體系和產(chǎn)物高通量檢測體系,通過單因素、Plackett-Burmandesign以及響應(yīng)面實驗對全合成培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,使得最終的尼莫克汀的產(chǎn)量能夠達(dá)到150.33 mg/L。之后通過搖瓶玻璃珠實驗以及裝液量實驗研究尼莫克汀發(fā)酵過程剪切和溶氧的影響,最終在5 L發(fā)酵罐中通過改變攪拌轉(zhuǎn)速以及槳型組合達(dá)到發(fā)酵體系高溶氧、低剪切,使得尼莫克汀最終產(chǎn)量達(dá)到191.59 mg/L。通過補糖補氨策略優(yōu)化研究進(jìn)一步提高了尼莫克汀的生物合成量。實... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 生物農(nóng)藥概述
    1.2 尼莫克汀概述
        1.2.1 尼莫克汀理化性質(zhì)
        1.2.2 尼莫克汀的生物合成及其研究現(xiàn)狀
    1.3 高通量篩選全合成培養(yǎng)基
        1.3.1 高通量技術(shù)概述
        1.3.2 全合成培養(yǎng)基概述
        1.3.3 高通量篩選全合成培養(yǎng)基
    1.4 發(fā)酵過程優(yōu)化
        1.4.1 溶氧與剪切優(yōu)化
        1.4.2 基于在線參數(shù)的補料策略優(yōu)化
    1.5 代謝物組學(xué)研究
    1.6 課題研究的背景、意義和內(nèi)容
        1.6.1 課題研究的背景和意義
        1.6.2 研究內(nèi)容
第2章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌種
        2.1.2 實驗儀器
        2.1.3 常用試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基配方
    2.2 培養(yǎng)方法
        2.2.1 斜面培養(yǎng)
        2.2.2 一級種子培養(yǎng)
        2.2.3 二級種子培養(yǎng)
        2.2.4 孔板發(fā)酵培養(yǎng)
        2.2.5 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
        2.2.6 5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
    2.3 分析與測定方法
        2.3.1 pH測定
        2.3.2 菌體干重測定
        2.3.3 葡萄糖試劑盒測定葡萄糖含量
            2.3.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
            2.3.3.2 發(fā)酵液中葡糖糖濃度測定
        2.3.4 銨離子濃度測定
            2.3.4.1 實驗主要測試試劑
            2.3.4.2 銨離子標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
            2.3.4.3 發(fā)酵液中銨離子濃度測定
        2.3.5 OUR和CER測定
        2.3.6 尼莫克汀含量測定
        2.3.7 菌體形態(tài)分析
第3章 尼莫克汀發(fā)酵全合成培養(yǎng)基的建立與優(yōu)化
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 單因素優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基
            3.2.1.1 碳源作用
            3.2.1.2 氮源作用
            3.2.1.3 磷源作用
        3.2.2 顯著因子的確定
        3.2.3 最佳培養(yǎng)基配方確定
        3.2.4 5L發(fā)酵罐驗證
        3.2.5 高通量檢測平臺建立
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 孔板裝液量確定
        3.3.2 高通量檢測平臺建立
        3.3.3 葡萄糖濃度對尼莫克汀發(fā)酵的影響
        3.3.4 麥芽糖濃度對尼莫克汀發(fā)酵的影響
        3.3.5 氮源對尼莫克汀發(fā)酵的影響
        3.3.6 磷酸氫二鉀對尼莫克汀發(fā)酵影響
        3.3.7 顯著因素的確定
        3.3.8 最佳培養(yǎng)基配方確定
        3.3.9 5L發(fā)酵罐驗證
    3.4 本章小結(jié)
第4章 基于在線參數(shù)調(diào)控的尼莫克汀發(fā)酵過程優(yōu)化
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 菌種和培養(yǎng)基
            4.2.1.1 菌種
            4.2.1.2 斜面培養(yǎng)基以及種子培養(yǎng)基
            4.2.1.3 5L發(fā)酵培養(yǎng)基
        4.2.2 培養(yǎng)方法
            4.2.2.1 5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
            4.2.2.2 葡萄糖和硫酸銨的補料策略
        4.2.3 分析與測定方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 搖瓶裝液量和玻璃珠數(shù)量對藍(lán)灰色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)尼莫克汀的影響
        4.3.2 5L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)速和供氧水平對尼莫克汀生物合成的影響
        4.3.3 在不同補糖策略下尼莫克汀發(fā)酵情況
        4.3.4 在不同補銨策略下尼莫克汀發(fā)酵情況
    4.4 本章小結(jié)
第5章 不同補銨策略對藍(lán)灰色鏈霉菌發(fā)酵合成尼莫克汀影響機(jī)制的探索
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 快速取樣裝置
        5.2.2 提取方法
        5.2.3 樣品衍生
        5.2.4 精確分析檢測方法建立
            5.2.4.1 GC-MS檢測方法
            5.2.4.2 LC-MS/MS檢測方法
13C同位素標(biāo)記品的制作">        5.2.5 ¹³C同位素標(biāo)記品的制作
        5.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 各類代謝物的最適提取方法
        5.3.2 5L發(fā)酵罐中在不同補銨策略下菌體生長以及尼莫克汀合成情況
        5.3.3 與尼莫克汀生物合成相關(guān)的關(guān)鍵代謝物和代謝途徑
        5.3.4 中心碳代謝途徑與尼莫克汀生物合成的關(guān)系
        5.3.5 氨基酸代謝尼莫克汀生物合成的關(guān)系
        5.3.6 輔酶A類物質(zhì)與尼莫克汀生物合成的關(guān)系
    5.4 本章小結(jié)
第6章 全文結(jié)論與展望
    6.1 全文總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間撰寫的論文及專利
附錄Ⅰ


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用基因工程定向阻斷尼莫克汀工業(yè)生產(chǎn)菌株中多個雜質(zhì)組份的生物合成[J]. 黨福軍,夏海洋,覃重軍.  中國抗生素雜志. 2014(08)
[2]農(nóng)用抗寄生蟲抗生素尼莫克汀發(fā)酵工藝的初步研究[J]. 張珊瑚,阮奇城,卞雯,董夢雯,劉雅潔.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2014(21)
[3]生物農(nóng)藥研究進(jìn)展與未來展望[J]. 邱德文.  植物保護(hù). 2013(05)
[4]Optimization of a synthetic medium for ethanol production by xylose-fermenting Zymomonas mobilis using response surface methodology[J]. DONG HuiNa 1,2,4,5,ZHAO XueMing 2,4,5,MA YuanYuan 1* & ZHANG MinHua 1,3 1 Tianjin University R&D Center for Petrochemical Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China;2 Department of Biochemical Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China;3 State Key Laboratory of Engines,Tianjin University,Tianjin 300072,China;4 Key Laboratory of Systems Bioengineering,Ministry of Education,Tianjin University,Tianjin 300072,China;5 Edinburgh-Tianjin Joint Research Centre for Systems Biology and Synthetic Biology,Tianjin University,Tianjin 300072,China.  Chinese Science Bulletin. 2012(Z2)
[5]攪拌槳葉型式對慶大霉素產(chǎn)生菌菌絲形態(tài)及其生物合成的影響[J]. 郭瑞文,儲炬,莊英萍,張嗣良.  中國抗生素雜志. 2005(08)
[6]絲狀微生物形態(tài)分析方法及影響形態(tài)的因素[J]. 李曉靜,陽葵,馮霞.  化學(xué)工業(yè)與工程. 2002(03)

碩士論文
[1]農(nóng)用抗生素尼莫克汀高產(chǎn)菌株的推理選育[D]. 王則.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號：3034534