低聚龍膽糖是葡萄糖單元通過β-1,6糖苷鍵連接而組成的功能性低聚糖,它是一種混合物,以龍膽二糖為主同時含有少量的龍膽三糖和龍膽四糖。低聚龍膽糖有著眾多優(yōu)良的生理功能,低熱、低甜、低水活性,不能被人體的消化酶所降解。目前,被廣泛的應(yīng)用到巧克力、冰淇凌、咖啡、調(diào)味品、烘烤食品、飲料等產(chǎn)品當(dāng)中。本研究將Trichoderma viride來源的β-葡糖糖苷酶基因bgl1連接到表達載體pPIC9K上,在Pichia pastoris KM71中表達,同時共表達二硫鍵異構(gòu)酶pdi,成功地獲得了能夠高效分泌表達β-葡糖糖苷酶的重組Pichia pastoris菌株,并將其在3.6 L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵優(yōu)化。研究了重組β-葡糖糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì),并優(yōu)化了利用重組β-葡糖糖苷酶的轉(zhuǎn)苷和逆水解活性來合成低聚龍膽糖的工藝條件。主要研究結(jié)果如下:（1）采用重疊PCR的方法從Trichoderma viride中獲得β-葡萄糖苷酶的目的基因bgll,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-bgl1,整合到Pichia pastoris KM71中。為了幫助二硫鍵的形成從而提高蛋白折疊效率,共表達二硫鍵異構(gòu)酶pdi,獲得重組P.... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?（３－葡萄糖苷酶反應(yīng)示意圖??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??

５００??２ｓ。ｍ??圖３－２重組質(zhì)粒ｐＰＩＣ９Ｋ－６ｇ／／雙酶切驗證??Ｍ：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；１：?ｐＰＩＣ９Ｋ－／）ｉ？／／雙酶切樣品??Ｆｉｇ．?３－２?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＰＩＣ９Ｋ－＾ｇ／７??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｉ：?ｐＰｌＣ９Ｋ－ｂｇｌＩ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?Ｎｏｔ?Ｉ?ａｎｄ?ＳｎａＢ?Ｉ??將經(jīng)鑒定正確的重組表達載體ｐＰＩＣ９Ｋ－ｋ／／用Ｉ單酶切線性化，膠回收純化后，??電轉(zhuǎn)至Ｐ／ｃ／ｚ／ａｐａｙ／ｏｒ／ｓ?ＫＭ７１感受態(tài)細胞中，然后涂布到ＭＤ平板上進行初步篩選，初??步篩選后用不同濃度的Ｇ４１８平板進行復(fù)篩，培養(yǎng)２－３?ｄ后從Ｇ４１８相對濃度較高的平板??上挑取單菌落到１０?ｍＬ?ＹＰＤ液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)２４?ｈ，�。玻�?ｍＬ菌液轉(zhuǎn)接到５０?ｍＬ??ＢＭＧＹ培養(yǎng)基培養(yǎng)２４?ｈ，再轉(zhuǎn)入２５?ｍＬ?ＢＭＭＹ液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在搖瓶中經(jīng)過甲醇??誘導(dǎo)，卩－葡萄糖苷酶成功的表達并分泌到發(fā)酵液中。在誘導(dǎo)１２０?ｈ時，Ｐ－葡萄糖苷酶酶??活達到ＳＳＵ．ｍＬ／１。發(fā)酵上清液經(jīng)．．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定，在７６ｋＤａ處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條??帶

活達到ＳＳＵ．ｍＬ／１。發(fā)酵上清液經(jīng)．．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定，在７６ｋＤａ處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條??帶，與理論的（３－葡萄糖苷酶的分子量相符，說明Ｐ－葡萄糖苷酶在ｉＰ／ｏ＾／ｗ．ｖ／ｗ／．ｖ?ＫＭ７１??中成功表達。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳如圖３－３所示。??ＫＤａ?Ｍ?１??９７．２?ＦＢ７；??６“??４４．３?？??２９：夢１??，３?—Ｂ??圖３－３．重組Ｐ－葡萄糖苷酶表達的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析??Ｍ：蛋白Ｍａｒｋｅｒ；?１：發(fā)酵上清??Ｆｉｇ．?３－３?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?ｉｎ?Ｐｉｃｈｉａ?ｐａｓｔｏｒｉｓ?ＫＭ７１??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?Ｃｕｌｔｕｒｅ?ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐ－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ??３丄２重組１＜；１＾７１／口１）１匚９１＜－／＾／＂卩卩１Ｒ遙粒?穡潁⒌墓菇?氨澩錚崳?７Ｗｃ／？ｏＡｒ願ｖ／ｒ／也ｐ－葡萄糖苷酶含有三對二硫鍵，當(dāng)該ｐ－葡萄糖苷酶在畢赤酵母中??快速表達時，有可能形成折疊不完整的二硫鍵。為了幫助二硫鍵的形成從而提高蛋白折??１７??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]糖苷水解酶第3家族β-葡萄糖苷酶的研究進展[J]. 周林芳,江波,張濤,李淑華.  食品工業(yè)科技. 2017(14)
[2]重組畢赤酵母生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件初步研究[J]. 劉玲玲,吳丹,朱威,陳晟,陳堅,吳敬.  工業(yè)微生物. 2010 (05)
[3]β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的選育及酶法轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)龍膽低聚糖[J]. 朱婧,覃擁靈,陳桂光,張云開,劉演景,羅杰,梁智群.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2010(04)
[4]一株產(chǎn)胞外中性β-葡萄糖苷酶菌株的鑒定及酶學(xué)特性研究[J]. 陳紅漫,趙璐,楊佳影.  食品科學(xué). 2009(15)
[5]重組β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)龍膽低聚糖的工藝條件優(yōu)化[J]. 劉玲玲,朱松,朱婷,張敏,吳敬,陳堅.  微生物學(xué)報. 2009(05)
[6]β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達研究進展[J]. 韓笑,陳介南,王義強,何鋼,劉海波,譚力.  生物技術(shù)通報. 2008(03)
[7]畢赤酵母工程菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 竇燁,王清路,李俏俏.  食品工業(yè)科技. 2008(06)
[8]β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的選育及其性質(zhì)研究[J]. 朱鳳妹,李軍,杜彬,劉長江.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(03)
[9]黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究進展[J]. 閆會平,陳士華,吳興泉.  纖維素科學(xué)與技術(shù). 2007(01)
[10]β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進展[J]. 潘利華,羅建平.  食品科學(xué). 2006(12)

碩士論文
[1]嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶的分子改造及高效表達[D]. 孫燁橙.江南大學(xué) 2016
[2]Streptomyces sp. FA1木聚糖酶在畢赤酵母中的表達、發(fā)酵優(yōu)化及應(yīng)用研究[D]. 徐洋.江南大學(xué) 2016
[3]Fusarium oxysporum磷脂酶B在畢赤酵母中的重組表達、發(fā)酵及應(yīng)用研究[D]. 吉得寧.江南大學(xué) 2016
[4]二硫鍵異構(gòu)酶過表達對家蠶乙酰膽堿酯酶在畢赤酵母中表達的作用研究[D]. 盧臨萍.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[5]黑曲霉α-葡萄糖苷酶在畢赤酵母中的高效表達研究[D]. 劉旭.江南大學(xué) 2013
[6]重組畢赤酵母表達β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵優(yōu)化[D]. 張建鴻.江南大學(xué) 2012
[7]β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化葡萄糖制備低聚龍膽糖的研究[D]. 劉玲玲.江南大學(xué) 2009
[8]重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)堿性果膠酶的策略研究[D]. 王蕓.江南大學(xué) 2008



本文編號：3023787