嗜甲醇巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）是使用最為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。其高效的醇氧化酶1啟動子(Promoter of alcohol oxidase 1,P_AOX1)可被甲醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)但同時也被甘油等碳源強(qiáng)烈抑制,而甲醇作為一種化工原料,其大規(guī)模應(yīng)用具有易燃易爆、碳源利用率低等缺陷。與甲醇相比,甘油等碳源具有易于代謝,還原力強(qiáng)等明顯優(yōu)勢,因此構(gòu)建甘油去阻遏型P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)具有很高的應(yīng)用價值,但需要從分子層面理解甘油抑制P_AOX1機(jī)制。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）中,HOT1是MAPK/HOG信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子,直接參與對多種甘油相關(guān)基因的調(diào)控,因此推測其在畢赤酵母中參與調(diào)控甲醇代謝。然而畢赤酵母MAPK/HOG信號通路的調(diào)控機(jī)制尚不清楚,HOT蛋白在MAPK/HOG信號通路及甲醇代謝中的調(diào)控機(jī)理需要深入研究�；诖�,本文鑒定了P.pastoris中高滲誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子HOT1和HOT2,并對其發(fā)揮作用的分子機(jī)制以及對甲醇代謝的調(diào)控... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

釀酒酵母中MAPK/HOG信號通路[39]

gRNA 設(shè)計采用在線網(wǎng)站設(shè)計，網(wǎng)站為 http://www.rgenomr 功能，選取 PAM type 物種：SpCas9 from Streptococcus pyogen擊 Organism Type，點(diǎn)擊 others，Komagataella pastoris；取 HOG1 和 HOT1/HOT2 的前 500 bp，并分別將序列輸入 Qu 0，點(diǎn)擊 Submit；出現(xiàn) sgRNA 序列（23 bp，包含 NGG）列表中，選擇較好的 tent：40-60%；Out-of-frame Score：≥66；Mismatches：0；取合適的 RGEN Target，如：AAGCAAGAGAAAGCCTTGGGCAAGAGAAAGCCTTGGA；擊 Cas OFFfinder，把選取的 20 bp sgRNA 序列輸入 Query Seq0，輸入20 bp sgRNA序列，如AAGCAAGAGAAAGCCTTGGA，RNA 的脫靶效應(yīng)，選擇無脫靶效應(yīng)的 sgRNA。 質(zhì)粒構(gòu)建思路如圖 2-1 所示，在引物的 3’端設(shè)計同源臂，通過段，之后通過 Gibson 組裝的方法將片段組裝至載體骨架上形成

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章 結(jié)果與討論oris中HOT蛋白的鑒定及功能研究oris HOT1/HOT2 的生物信息學(xué)分析酵母 HOT1 為模板利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫中 BLAST 功能尋找 P. 列表中共兩個基因，基因 ID 分別為：254565367 和 25455738在不同的基因組注釋中均被注釋為 HOT1，為了加以區(qū)為 HOT1，2545573854 稱為 HOT2。

【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]畢赤酵母醇氧化酶啟動子調(diào)控相關(guān)激酶的研究與應(yīng)用[D]. 沈偉.華東理工大學(xué) 2017
[2]畢赤酵母AOX1啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究[D]. 王小龍.華東理工大學(xué) 2016
[3]甘油去阻遏表型巴斯德畢赤酵母（Pichia Pastoris）的構(gòu)建及其初步研究[D]. 姚學(xué)勤.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2009

碩士論文
[1]甘油對巴斯德畢赤酵母甲醇代謝影響的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D]. 李翔.江南大學(xué) 2018
[2]谷氨酸棒桿菌表達(dá)組件的開發(fā)及應(yīng)用[D]. 趙子豪.江南大學(xué) 2017



本文編號：2981535