丙酮和異丙醇作為重要的有機(jī)化合物,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等行業(yè)。丙酮（異丙醇）發(fā)酵法是生產(chǎn)丙酮（異丙醇）的傳統(tǒng)生物方法。但目前微生物發(fā)酵法因其產(chǎn)物特異性差、糧食基底物消耗大而受到了限制。利用成本低、效益高的非糧食基底物進(jìn)行特異性合成丙酮和異丙醇成為研究熱點(diǎn)。乙酸是一種可以通過生物法和化學(xué)合成法制備的廉價(jià)一元酸。與此同時(shí),它也大量存在于許多制造業(yè)的廢水中。大腸桿菌可以好氧代謝乙酸進(jìn)行生長(zhǎng),但以乙酸為唯一碳源來生產(chǎn)丙酮及異丙醇則沒有被報(bào)道。對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因改造修飾具有相當(dāng)?shù)臐摿斫鉀Q這些問題。本課題通過在大腸桿菌MG1655中組合表達(dá)Clostridium acetobutylicum來源的基因（硫解酶thl、乙酰乙酸脫羧酶adc、輔酶A轉(zhuǎn)移酶ctfAB）和大腸桿菌來源的基因（輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶atoB、輔酶A轉(zhuǎn)移酶atoDA）合成丙酮。在乙酸為唯一碳源下,以thl、attoDA、adc為最優(yōu)的丙酮合成途徑。并通過背景菌株改造,過表達(dá)基因ack-pta以提高乙酸攝取、敲除基因pckA、maeBB來削弱糖異生途徑、敲除基因icdA來阻斷TCA循環(huán)途徑提高了丙酮得率。結(jié)合靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化與氣提... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１丙酮代謝途徑簡(jiǎn)圖??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ?ｍｅｔａｂｏｌｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ａｃｅｔｏｎｅ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??

利用ＥＣＯＣＹＣ及ＮＣＢＩ網(wǎng)站，查找并下載ｐＴｒｃ９９ａ質(zhì)粒圖譜與相關(guān)基因（從／，Ｃ抑（７／ＯＺＸ４）序列。梭菌丙酮合成途徑的反應(yīng)順序?yàn)椋郑��？紤]到大桿菌中除了不含有乙酰乙酸脫羧酶，存在兩種酶的同工酶。對(duì)這兩種不同來源的基因行組合，可以得到?４?種質(zhì)粒組合。即：（（７／〇５，說／ｃ，?Ｃ／／４５），（ａ／減“成?（／／？／，?ａｄｃ，?Ｃ／／４和（／／７／，Ｗｃ，加ＺＸ４）；用Ｖｅｃｔｏｒ軟件，設(shè)計(jì)基因連接順序并進(jìn)行電子克隆。??

ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｎｇ?＂７／?（Ｃ．?ａｃｅ／ｏｉｗ／ｙ／ｚ’ｃｗｗ）?ｇｅｎｅ?ｏｆ?ｔｈｉｏｌａｓｅ、ａｄｃ?（Ｃ．?ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）?ｇｅｎｅ?ｏｆ?ａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ??ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、７＞ｃ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ａｔｏＤＡ?（Ｅ．?ｃｏｌｉ）?ｇｅｎｅ?ｏｆ?ＣｏＡ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．??電子克隆結(jié)果如圖３．１：按照天然丙酮合成天然途徑的反應(yīng)順序，在ｐＴｒｃ９９ａ質(zhì)粒??／／ｒ啟動(dòng)子后插入也ｏＳ／從／基因，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的ＲＢＳ序列以連接基因。為有效表達(dá)??三個(gè)基因，再引入一個(gè)帶有終止子元件的／ｒｃ啟動(dòng)子元件，在該元件后連接如??基因。以此得到質(zhì)粒大小分別為?ｐＴｒｃＢＡＣ?（７７４８?ｂｐ）、ｐＴｒｃＢＡＤ?（７７３７?ｂｐ）、ｐＴｒｃＴＡＣ??（７７３０ｂｐ）、ｐＴｒｃＴＡＤ?（７７１９ｂｐ）。質(zhì)粒的詳細(xì)描述見第二章２．１．２。后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將??以電子克隆為參考進(jìn)行。??３．２．１．１目的基因的獲取??分別以丙丁梭菌Ｃ．?菌體、大腸桿菌ＭＧ１６５５菌體為擴(kuò)增模版，ＰＣＲ??擴(kuò)增／／？／、ｃ抑Ｂ、偷５、基因序列，其中／／？／與?ａｔ／ｃ?之間的??ＲＢＳ?序列以及?與?ｃ／ｔ／ｃ？之間的?ＲＢＳ?序列由（ｈＵｉ，ｓ：／／ｓａ丨ｉｓ?１?ａｂ．ｌｉｅｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｏｒｗａｒｄ）網(wǎng)頁(yè)??軟件計(jì)算得出。獲得各基因片段后，再通過ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲ獲得／Ｗ－ＲＢＳ－ａ也與ａ／ｏＳ－ＲＢＳ－??〇辦片段。由于需要在ｐＴｒｃ９９ａ表達(dá)載體上表達(dá)３個(gè)基因，僅載體上的一個(gè)Ｔｒｃ啟動(dòng)子，??表達(dá)強(qiáng)度不夠。因此

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]異丙醇的應(yīng)用及國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)[J]. 胡紅嫣.  當(dāng)代石油石化. 2003(05)
[2]丙酮的生產(chǎn)與發(fā)展[J]. 韓大維,薛麗梅,王煥民,王鏡石.  化學(xué)與粘合. 1996(04)
[3]異丙醇的制取與利用[J]. 姜淑蘭,張威.  黎明化工. 1993(04)
[4]丙酮的加工產(chǎn)品[J]. 張旭東.  山西化工. 1988(03)



本文編號(hào)：2924732