維生素C(Vc)是人體所需的重要水溶性維生素,在食品行業(yè)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值,其衍生物通常作為抗氧化劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加在食品中。維生素C的前體物質(zhì)2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)可通過微生物發(fā)酵的方法獲得,這種方法稱為二步發(fā)酵法,二步發(fā)酵法的第二步為混菌發(fā)酵,其中包括作為伴生菌的芽孢桿菌和作為產(chǎn)酸菌的普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonicigenium vulgare),兩菌的關(guān)系為互利共生,但互作機(jī)制還不完全明確。已知多種芽孢桿菌均可作為伴生菌,但伴生效果各不相同,對混菌發(fā)酵過程伴生菌解除產(chǎn)酸菌氧化脅迫機(jī)制的解析,和對不同伴生菌伴生效果不同機(jī)制的解析,將有助于探究兩菌互作的分子機(jī)制,為后續(xù)利用生物學(xué)手段提升維生素C發(fā)酵生產(chǎn)水平奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和方法學(xué)基礎(chǔ),同時(shí)還可為其他復(fù)雜微生物群落的研究提供線索。本文主要研究結(jié)果如下:首先對Bacillus endophyticus ST-1和K.vulgare 25B-1單菌及Vc混菌發(fā)酵體系的生理特性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)B.endophyticus ST-1促進(jìn)了K.vulgare 25B-1的生長和產(chǎn)酸,同時(shí)K.vulgare 25B-1促進(jìn)了B.endophyticus ST-1芽孢的生成,在發(fā)酵后期,發(fā)酵體系2-KLG產(chǎn)量逐漸增多,影響了B.endophyticus ST-1的生長;混菌發(fā)酵中B.endophyticus ST-1芽孢2,6-吡啶二羧酸(2,6-pyridinedicarboxylic acid,DPA)的含量高于單菌發(fā)酵,K.vulgare 25B-1促進(jìn)了伴生菌芽孢的生成;混菌發(fā)酵體系pH值比單菌發(fā)酵體系穩(wěn)定,有利于K.vulgare 25B-1的生長于產(chǎn)酸;混菌發(fā)酵體系的氧化還原電位(oxidation-reduction potential,ORP)隨著發(fā)酵的進(jìn)行,逐漸降低,并且與2-KLG產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。在K.vulgare 25B-1中,獲得4個(gè)山梨糖脫氫酶基因Kvsdh1、Kvsdh2、Kvsdh3、Kvsdh4和1個(gè)山梨酮脫氫酶基因Kvsndh1,這兩種酶與2-KLG的生成相關(guān);生物信息學(xué)分析顯示,這5種蛋白的穩(wěn)定性較好,為水溶性蛋白,僅Kvsdh1編碼蛋白為膜結(jié)合蛋白,四個(gè)山梨糖脫氫酶的三級結(jié)構(gòu)形態(tài)類似,并在Kvsdh1編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)中預(yù)測到一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)結(jié)合位點(diǎn),Kvsdh4編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)中也存在一個(gè)PQQ結(jié)合位點(diǎn)。在混菌發(fā)酵中山梨糖脫氫酶基因的表達(dá)和酶活逐漸升高在40 h達(dá)到最高,隨后下降;山梨酮脫氫酶基因的表達(dá)在混菌發(fā)酵中逐漸升高在66 h達(dá)到最高。分析混菌發(fā)酵體系對自身氧化脅迫的應(yīng)激響應(yīng),發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵中兩菌胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平均在18 h大幅度提高,隨后逐漸降低;混菌發(fā)酵過程中胞外總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力、過氧化氫酶活力(catalase,CAT)和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)均逐漸升高;對兩菌抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn),B.endophyticus ST-1直接清除ROS的酶基因sodA和katE表達(dá)量升高,與氧化還原狀態(tài)相關(guān)基因gp和zwf表達(dá)升高,K.vulgare25B-1基因grxC、gor、sodB和zwf表達(dá)上調(diào);這些結(jié)果說明,在混菌發(fā)酵中,B.endophyticus ST-1促進(jìn)了K.vulgare 25B-1的生長和產(chǎn)酸,由于代謝能力增強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的積累,引發(fā)自身氧化脅迫,并通過某些信號分子將這種信號傳遞給B.endophyticus ST-1,B.endophyticus ST-1感受到這種信號,調(diào)控一系列與抗氧化和調(diào)節(jié)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境相關(guān)基因的表達(dá)和活性物質(zhì)的產(chǎn)生。同時(shí)K.vulgare 25B-1也促進(jìn)了B.endophyticus ST-1芽孢的生成,B.endophyticus ST-1芽孢釋放母細(xì)胞裂解,將胞內(nèi)液釋放到混菌發(fā)酵體系中,不僅為K.vulgare 25B-1提供了營養(yǎng)因子,同時(shí)也為其提供了良好的氧化還原環(huán)境,提高了K.vulgare 25B-1抗氧化能力。對不同混菌發(fā)酵體系伴生菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),伴生菌B.pumilus A9與B.endophyticus ST-1均可以促進(jìn)K.vulgare 25B-1的生長,B.pumilus A9的伴生能力更好,Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示兩個(gè)發(fā)酵體系的ORP與2-KLG產(chǎn)量均在0.01水平上顯著負(fù)相關(guān)。Bacillus蛋白組分析顯示,在不同伴生菌的混菌發(fā)酵體系中,B.pumilus A9比B.endophyticus ST-1糖代謝能力更強(qiáng),為細(xì)胞提供了更多的能量和還原力,為產(chǎn)酸菌提供了更充足的中間代謝產(chǎn)物;在氨基酸生物合成通路中,B.pumilus A9與B.endophyticus ST-1相比促進(jìn)了甘氨酸和絲氨酸間的相互轉(zhuǎn)化,及蘇氨酸的合成,增強(qiáng)了谷氨酸的合成并轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺。對Bacillus共有差異蛋白的生物信息學(xué)分析顯示,B.pumilus A9與K.vulgare 25B-1更能很好的配合,可以同時(shí)利用兩種途徑進(jìn)行糖代謝,代謝能力較強(qiáng);在核糖體蛋白通路中,伴生菌B.pumilus A9與溫度相關(guān)的大亞基核糖體蛋白L6、L22和L23表達(dá)的上調(diào);同時(shí)發(fā)現(xiàn),B.pumilus A9具有更好的抗氧化能力,對發(fā)酵體系氧化還原平衡的調(diào)節(jié)能力更強(qiáng)。對不同混菌發(fā)酵體系產(chǎn)酸菌K.vulgare 25B-1蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),伴生能力強(qiáng)的B.pumilus A9促進(jìn)了K.vulgare 25B-1的三羧酸循環(huán)(TCA)和丙酮酸的代謝,并促進(jìn)了多種氨基酸的合成代謝,有利于蛋白質(zhì)的合成,代謝能力的增強(qiáng)。在維生素和輔因子代謝通路中,與維生素B_6代謝相關(guān)的酶5'磷酸吡哆胺氧化酶表達(dá)的上調(diào),促進(jìn)了吡哆醇的生成,有利于氨基酸的轉(zhuǎn)氨、脫羧和含硫氨基酸的脫硫。在葉酸一碳單位通路中,相關(guān)酶表達(dá)的上調(diào),增強(qiáng)了一碳單位的通量,為菌體生長提供必要物質(zhì)基礎(chǔ)。肽聚糖合成相關(guān)的酶表達(dá)的上調(diào),說明B.pumilus A9更有利于產(chǎn)酸菌肽聚糖的合成和細(xì)胞壁的形成。在K.vulgare 25B-1中,只發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白,分別是鐵超氧化物歧化酶和受Spx調(diào)控的硫氧還蛋白還原酶,這兩個(gè)蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢,可見產(chǎn)酸菌在伴生菌B.pumilus A9的伴生條件下清除活性氧的能力得到了提高,同時(shí)調(diào)控硫醇平衡的能力也得到了增強(qiáng),消除了環(huán)境中不利于細(xì)胞生長因素,促進(jìn)了產(chǎn)酸菌的生長代謝。本文通過對Bacillus endophyticus ST-1和K.vulgare 25B-1單菌及Vc混菌發(fā)酵體系的生理特性、產(chǎn)酸菌產(chǎn)酸酶系基因表達(dá)和酶活變化及單菌和混菌發(fā)酵體系抗氧化酶活性和基因表達(dá)的分析,闡明了伴生菌解除產(chǎn)酸菌氧化脅迫的分子機(jī)制;通過對不同發(fā)酵體系兩菌的蛋白組進(jìn)行分析,揭示了糖代謝能力和抗氧化能力強(qiáng)的伴生菌,具有更好的伴生效果。
【學(xué)位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

論文研究框架

計(jì)算 DPA 濃度。與分析發(fā)酵體系中菌體的生長曲線菌體 OD（optical density）值的變化可反映菌體的生長狀態(tài)，hyticus ST-1 和 K. vulgare 25B-1 的 OD650如圖 2-1 所示�；炀l(fā)酵體濃度高于單菌發(fā)酵中 K. vulgare 25B-1 的菌體濃度，在 24 h 25B-1 的菌體濃度為單菌發(fā)酵的 6 倍，隨后呈下降趨勢，這表明vulgare 25B-1 的生長，在混菌發(fā)酵中 K. vulgare 25B-1 的生長在 漸進(jìn)入衰亡期；在 0 h - 35 h 期間，混菌發(fā)酵中 B. endophyticu菌發(fā)酵，可見 K. vulgare 25B-1 促進(jìn)了 B. endophyticus ST-1 的endophyticus ST-1 的生長為單菌發(fā)酵時(shí)的 4.6 倍，而在 35 h 后混us ST-1 的菌體濃度低于單菌發(fā)酵，說明其生長受到了抑制。

圖 2-2 不同發(fā)酵體系中 B. endophyticus ST-1 的 DPA 含量變化（A）DPA 含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 （B）不同發(fā)酵體系中 B. endophyticus ST-1 的 DPA 含量變化Figure 2-2 Variations in DPA of B. endophyticus ST-1in different fermentation systems(A) The standard curve of DPA concentration (B) Variations in DPA of B. endophyticus ST-1in differentfermentation systems2.3.3 不同發(fā)酵體系 pH 變化
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2888193