聚羥基脂肪酸酯是一種天然生物聚酯,因其具有良好的生物相容性和生物可降解性而在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品以及材料行業(yè)有著廣泛的應用,聚3-羥基丁酸酯為較早被發(fā)現(xiàn)的可降解型生物聚酯,但其在材料學性質(zhì)上有一定的局限性,如較低的延展性限制了其進一步的應用,在聚3-羥基丁酸酯中加入3-羥基丙酸單體可改善共聚物的材料學性質(zhì),但是早期研究中3-羥基丙酸及含3-羥基丙酸單體的共聚物的生物合成都依賴于3-羥基丙酸或其結(jié)構相關前體,如丙烯酸、1,3-丙二醇等,這些單體價格昂貴,且會造成環(huán)境污染。本研究以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16為出發(fā)菌株,該菌株具備以下2個重要特性:一是能夠分泌一種胞外酯酶降解周圍環(huán)境中的油脂使之變?yōu)楦视团c游離脂肪酸,二是具備二個油脂降解(beta氧化途徑)基因簇,有利于游離脂肪酸的轉(zhuǎn)入與降解,使之可利用油脂為唯一碳原進行生長和代謝。本研究通過染色體重組技術將外源的3-羥基丙酸合成途徑整合至出發(fā)菌株,構建的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16工程菌,可以油脂為唯一碳源,一步合成3-羥基丁酸與3-羥基丙酸的共聚物P(3HB-co-3HP)。本實驗同時通過索氏提取以及冰乙醇沉淀相結(jié)合的方法從菌體中分離到了純化產(chǎn)物,并通過核磁分析方法對共聚物的結(jié)構以及單體組成進行了分析,通過凝膠色譜確定共聚物的分子量分布。最終的分析結(jié)果確定了目標產(chǎn)物P(3HB-co-3HP)的生物合成。本研究在工程菌構建部分的研究工作中將已酰輔酶A羧化酶(accADBC)、丙二酰單酰輔酶A還原酶(mcr)和丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(pct)三個關鍵酶的基因?qū)肽繕斯ぷ髻|(zhì)粒pBBR-pct-mcr-accADBC;并通過結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法構建了產(chǎn)P(3HB-co-3HP)的工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌。該工程菌在5L發(fā)酵罐水平以大豆油為碳源發(fā)酵得到DCW(細胞干重)為6.08 g/L,共聚物產(chǎn)量3.11 g/L(占細胞干重的51.15%)。共聚物中3-羥基丙酸與3-羥基丁酸單體的比例約為1:2,共聚物分子量達到200000。本研究的發(fā)酵優(yōu)化實驗中證明誘導劑阿拉伯糖濃度對工程菌株生產(chǎn)P(3HB-co-3HP)的影響較大。在將其它發(fā)酵條件設置為控制變量的條件下,在工程菌搖瓶發(fā)酵過程中對數(shù)生長期分別加入阿拉伯糖濃度至0.25 mol/L、0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L,DCW分別為1.52 g/L、2.11 g/L、1.56 g/L和1、21 g/L,P(3HB-co-3HP)分別占細胞干重的57.33%,62.42%,56.76%,52.41%,進一步通過核磁氫譜分析表明,當阿拉伯糖終濃度為0.25 mol/L、0.5 mol/L時,產(chǎn)物為P(3HB-co-3HP),當誘導劑終濃度為1 mol/L、2 mol/L時,產(chǎn)物為P3HB。并測得聚合物的熔點會隨著3HP含量的增加而降低。最后本研究還構建了可以高效利用甘油的工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌,與未改造的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16相比,表達glpk(甘油激酶)的工程菌大大提高了甘油的利用效率。以甘油為唯一碳源時,工程菌株生長狀況明顯好于對照菌株,DCW達到=2.16 g/L,PHB產(chǎn)量為細胞干重的68.21%。在此基礎上本研究進一步構建質(zhì)粒pBBR-pct-mcr-accADBC-glpk,探究glpk基因的導入對工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌產(chǎn)共聚物P(3HB-co-3HP)影響,此部分研究在質(zhì)粒構建部分失敗。
【學位單位】：青島科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ314.1
【部分圖文】：

堿桿菌產(chǎn) 3-羥基丙酸和 3-羥基丁酸共聚物的生據(jù)單體單元的組成，聚羥基鏈烷酸酯（的各種機械性能[12]。酯的生產(chǎn)菌株開發(fā)，搖瓶優(yōu)化，實驗室和試驗發(fā) 的有效微生物生產(chǎn)取決于若干因素，包 細胞干重（CDW）百分比，達到最終細率，底物價格，以及提取和純化 PHA 的數(shù) PHA 大規(guī)模生產(chǎn)用于商業(yè)開發(fā)。所有以實現(xiàn)高細胞密度增長。然而，連續(xù)過程來越多地，使用混合培養(yǎng)物生產(chǎn) PHA 變

本課題技術路線

青島科技大學研究生學位論文2 產(chǎn) P(3HB-co-3HP)工程菌的構建2.1 引言P(3HB-co-3HP)是一種綠色環(huán)保的生物材料，然而，在自然界中沒有一條已知的代謝途徑能夠合成該聚合物，本實驗我們選擇真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌為出發(fā)菌株，因為該菌株不僅僅能夠利用油脂，而且其染色體上具有合成聚羥基丁酸酯的三個關鍵基因，分別是 PHA 合酶(PhaC)、3-酮硫裂解酶(PhaA)和乙酰乙酰 CoA 還原酶(PhaB)，在已知的代謝途徑中整合 3-羥基丁酸的合成途徑，理論上能夠生產(chǎn)P(3HB-co-3HP) ， 這 一 部 分 主 要 為 構 建 新 的 代 謝 途 徑 ， 合 成 目 標 產(chǎn) 物P(3HB-co-3HP)。
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 楊鵬;王琦;咸漠;薛永常;趙廣;;聚3-羥基丙酸及其共聚物的生物合成[J];科學通報;2014年22期

本文編號：2887829