S-腺苷甲硫氨酸(SAM),即S-腺苷-L-甲硫氨酸,是一種重要的生理活性物質(zhì)。通過轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫基、轉(zhuǎn)氨丙基等作用,SAM參與了生物體內(nèi)40多種生化反應(yīng)。臨床研究表明,SAM對肝臟疾病、抑郁癥和關(guān)節(jié)炎等均具有較好的治療效果。隨著對SAM臨床研究的深入,SAM對其他疾病的藥理作用也不斷被證實,包括阿爾茲海默癥、偏頭痛、腫瘤等。目前,工業(yè)上主要是利用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)SAM。但該方法存在生產(chǎn)周期長、底物轉(zhuǎn)化率低、提取過程復(fù)雜等問題。相比較而言,酶催化法具有反應(yīng)時間短、提取過程較簡單等優(yōu)勢。S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)是生物體內(nèi)唯一一種用于SAM合成的酶。它催化ATP和L-甲硫氨酸反應(yīng)生成SAM,同時生成副產(chǎn)物正磷酸(Pi)和焦磷酸(PPi)。為了選取一種合適的MAT用于SAM的生產(chǎn),本研究根據(jù)國內(nèi)外對MATs的報道以及實驗室常用的菌株,選取了 8種用于合成MAT的基因,用質(zhì)粒pET-28a(+)在大腸桿菌BL21(DE3)中進行異源表達。通過比較誘導(dǎo)表達后重組菌的菌體密度和酶的性質(zhì),發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌MAT基因的菌株誘導(dǎo)表達后菌體密度較高、蛋白表達量較高、比酶活較高,因此對其進行進一步研究。考慮到大腸桿菌來源的MAT(eMAT)比酶活僅為1.82 U/mg,且當(dāng)反應(yīng)體系中SAM濃度超過1 mM,eMAT相對酶活不超過20%,這將不利于SAM的合成,因此對其催化活性進行分子改造。首先,根據(jù)檢測Pi的分光光度法成功構(gòu)建了適用于本研究的高通量篩選方法,并通過優(yōu)化易錯PCR體系中Mn2+濃度成功構(gòu)建了以eMAT為親本的有效突變體文庫。經(jīng)過不斷的初篩和復(fù)篩,獲得一個有效突變體R74H,比酶活從野生型eMAT的1.82 U/mg增加至4.15 U/mg。與此同時,根據(jù)文獻中有關(guān)MATs酶活的報道,以野生型eMAT為親本,基于同源序列對比結(jié)果進行定點突變,獲得突變體I303V和I65V,比酶活分別為2.76 U/mg和4.57 U/mg。為了考察突變體用于SAM生產(chǎn)的可行性,測定不同底物濃度下SAM積累量。結(jié)果表明,10 mM底物濃度下,野生型eMAT SAM積累量僅為1.62 mM,突變體R74H、I65V、I303V SAM積累量分別為1.48 mM、1.84 mM和2.40 mM。比較SAM對底物的抑制常數(shù)發(fā)現(xiàn),突變體I303VKi,ATP為0.20 mM、Ki,L-met為0.23 mM,而突變體R74HKi,ATP為0.05 mM、Ki,L-met為0.20 mM。說明在該酶反應(yīng)體系中,產(chǎn)物抑制是影響SAM合成的主要因素。因此,以產(chǎn)物抑制較輕的突變體I303V為親本進行分子改造,以期減輕eMAT的產(chǎn)物抑制�？紤]到突變體I65V產(chǎn)物抑制較野生型eMAT減輕,首先通過定點突變將303位和65位進行組合。eMAT嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制可能是由于SAM阻止了 ATP與酶的結(jié)合。而ATP位于活性中心,因此對活性中心附近非保守性位點進行半理性設(shè)計。結(jié)果表明,突變體I303V/I65V/L186V不僅在10 mM底物濃度下的SAM積累量從突變體I303V的2.44 mM增加至3.27 mM,比酶活也提高1.54倍。雖然突變體I303V/I65V/N104A比酶活提高1.3倍,但10 mM底物濃度下的SAM積累量不超過2 mM,因此對104位進行定點飽和突變。通過高通量篩選,獲得的突變體 I65V/I303V/L186V/N104K 比酶活從突變體 I65V/I303V/L186V 的 3.78 U/mg增加至6.02 U/mg,但在10 mM底物濃度下的SAM積累量下降至2.68 mM。另外,突變體I65V/I303V/L186V/N104K最適反應(yīng)溫度為55℃,最適反應(yīng)pH為8.0,37℃熱處理8 h后酶活仍有80%的殘余;而野生型eMAT最適反應(yīng)溫度為60℃,最適反應(yīng)pH為8.4,37℃熱處理8 h后酶活僅殘余30%�？傮w而言,本研究通過分子改造獲得的突變體I65V/I303V/L186V/N104K的催化性能較野生型eMAT和已報道MATs均有明顯提高。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ426.97;TQ463
【部分圖文】：

１．２?ＳＡＭ的理化性質(zhì)??１．２．１?ＳＡＭ的結(jié)構(gòu)分析??ＳＡＭ結(jié)構(gòu)式于１９５２年被Ｃａｎｔｏｎｉ所闡明ｍ。由圖１．１可看出，ＳＡＭ分子中??不僅含一個永久帶正電荷的極性較強的锍基（ｐＫａ＝１２．５），還含有三個可解離的??基團，分別為：與嘌呤環(huán)相連的氨基（ｐＫａ＝３．４）、Ｌ－甲硫氨酸殘基的氨基（ｐＫａ＝７．８）??和Ｌ－甲硫氨酸殘基的銨基（ｐＫａ＝１．８）。強極性的锍基使得與其相連的碳被活化，??因此易受親核試劑的攻擊而發(fā)生裂解反應(yīng)；三個可解離基團解離常數(shù)的差異，使??得ＳＡＭ的水解受ｐＨ影響較大。??１．２．２?ＳＡＭ的穩(wěn)定性??ＳＡＭ的穩(wěn)定性較差，在室溫中性或堿性ｐＨ條件下，很容易失活。除１．２．１??結(jié)構(gòu)分析中所提到的因锍基而引起的裂解失活和ｐＨ等因素引起的水解失活兩種??失活機制外，ＳＡＭ還會因自發(fā)發(fā)生消旋反應(yīng)而失去活性［９—１（）１。??為提高ＳＡＭ的穩(wěn)定性，工業(yè)上一般都是以ＳＡＭ鹽的形式在低溫避光干燥??的環(huán)境中保存ＳＡＭ。在ＳＡＭ成鹽時

比于化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，酶催化法因具有立體選擇性高、反應(yīng)反應(yīng)時間短、產(chǎn)物易分離、對環(huán)境友好等特點，成為近年來研究ＳＡ點方向。ＭＡＴ雖然廣泛存在動物、植物和微生物，但天然表達的ＭＡＴ分離純化困難，因而限制了酶催化法的大規(guī)模使用。因此，構(gòu)建高效的工程菌成為用酶催化法制備ＳＡＭ的首要任務(wù)。目前，有關(guān)ＭＡＴ的中在動物肝臟、釀酒酵母以及大腸桿菌三種來源的ＭＡＴ上。??

的測定??Ｐｉｅｒｃｅ１?Ｍ?ＢＣＡ?Ｐｒｏｔｅｉｎ?Ａｓｓａｙ?Ｋｉｔ微孔板法進行測定，說明書進行，具體步驟如下：??００?ｍＭ?Ｔｒｉｓ－ＨＣ丨將ＢＳＡ標(biāo)準(zhǔn)液按說明書稀釋Ａ－Ｆ?６ＣＡ?Ｒｅａｇｅｎｔ?Ａ?與?ＢＣＡ?Ｒｅａｇｅｎｔ?Ｂ?以?５０：１?（ｖ／ｖ）充ｎｔ?（ＷＲ）備用；??孔板中加入２５?（ｉＬ樣品或標(biāo)準(zhǔn)液稀釋液，每個樣品個孔中繼續(xù)加入２００?ｐＬＷＲ，振蕩混勻；??孔板加蓋后置于３７?°Ｃ培養(yǎng)箱中，保溫３０?ｍｉｎ；??孔板冷卻后，用酶標(biāo)儀于５６２?ｎｍ處測量吸光值；??蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算樣品蛋白的濃度。蛋白。??
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本文編號：2879964